eEF1A Antibody [P21C20]
目录号: F5596
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: MCF7, Lane 2: 293, Lane 3: PANC-1, Lane 4: C2C12
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
|---|
| WB |
| 反应性 |
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| Human, Mouse, Rat, Monkey |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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50 kDa
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| 阳性对照 | MCF‑7 cells; 293 cells; PANC‑1 cells; RD cells; C2C12 cells; KNRK cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| eEF1A Antibody [P21C20] 可检测内源性 eEF1A 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞膜，细胞质，内膜系统，细胞核 |
| Uniprot ID |
|---|
| P68104 |
| 克隆号 |
|---|
| P21C20 |
| 别名 |
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| Elongation factor 1-alpha 1; EF-1-alpha-1; Elongation factor 1 A-1; eEF1A-1; Eukaryotic elongation factor 1 A-1; EEF1A1; EF1A; LENG7 |
| 背景 |
|---|
| eEF1A是真核生物翻译延伸因子1复合物的GTP酶亚基，在真核生物蛋白质合成过程中将氨酰tRNA递送至核糖体A位点。它具有紧凑的GTP结合折叠，包含三个结构域，这些结构域在GTP结合态和GDP结合态之间发生构象变化，从而在开放和封闭构象之间循环。在GTP结合状态下，eEF1A与氨酰tRNA和鸟嘌呤核苷酸交换因子eEF1B形成三元复合物，促进核糖体A位点的密码子-反密码子精确匹配，随后由核糖体的沙门氏菌-蓖麻毒素环和SRL GTP酶激活中心触发GTP水解。水解后，GDP结合的eEF1A解离，使得eEF1B介导的核苷酸交换能够重置循环，同时校对机制通过动力学区分同源tRNA和近同源tRNA来确保翻译的准确性。除了促进细胞延伸外，eEF1A还能束起肌动蛋白丝并稳定微管，它与F-肌动蛋白、微管蛋白和突触蛋白相互作用，从而调节生长锥和突触后致密区的细胞骨架动力学。Raf激酶在Ser21和Thr88等位点的磷酸化会改变癌细胞中eEF1A的稳定性、半衰期和凋亡敏感性；而热休克激活eEF1A，使其通过非编码的HSR1 RNA募集HSF1至HSP70启动子，在转录延伸过程中与RNA聚合酶II结合，通过3'UTR结合稳定HSP70 mRNA，促进其核输出，并将其导向多聚核糖体进行无应激颗粒的翻译。 eEF1A亚型表现出组织特异性表达，其中eEF1A1普遍存在，而eEF1A2则富集于脑和肌肉组织中。它们通过与HSC70和Bag-6相互作用，支持蛋白质稳态、信号转导以及错误折叠蛋白的蛋白酶体递送。eEF1A活性失调会通过改变翻译保真度和应激反应，导致神经退行性疾病和肿瘤发生。 |
| 参考文献 |
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