ENPP2/ATX Antibody [J20P19]
目录号: F3713
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Hela, Lane 2: U-87 MG, Lane 3: A375, Lane 4: Mouse placenta
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IF, FCM |
| 反应性 |
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| Human, Mouse |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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98 kDa
100 kDa,36 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Human ovary cancer tissue; Human placenta tissue; Human thymus tissue; Human testis tissue; MCF7 cells (BFA, 300ng/ml, 24 h) |
|---|---|
| 阴性对照 | Human skeletal muscle tissue |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
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实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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生物描述
| 特异性 |
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| ENPP2/ATX Antibody [J20P19] 可检测内源性 ENPP2/ATX 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
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| 细胞外环境 |
| Uniprot ID |
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| Q13822 |
| 克隆号 |
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| J20P19 |
| 别名 |
|---|
| ATX; PDNP2; ENPP2; Autotaxin; Ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase family member 2; Extracellular lysophospholipase D; E‑NPP 2; LysoPLD |
| 背景 |
|---|
| ENPP2，俗称自泌素（ATX），是一种分泌型外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶，可将溶血磷脂酰胆碱水解为具有生物活性的溶血磷脂酸（LPA），从而驱动细胞运动、血管成熟和组织修复的关键信号通路。ATX 产生 LPA 梯度，激活 LPAR1-6 G 蛋白偶联受体，进而激活 Gαq/PLCβ 通路，促进钙释放和 RhoA/ROCK 介导的肌动蛋白收缩；同时激活 Gαi/PI3K/Akt 通路以促进细胞存活，以及激活 Gα12/13/PKA 通路以促进趋化作用。此外，ATX 与整合素 αvβ3/α5β1 的直接相互作用将 LPA 递送至细胞前缘，从而增强 FAK/Src 信号通路，促进黏着斑的更新。这促进了胚胎血管生成过程中的定向迁移，其中ATX-LPA促进内皮细胞萌芽和血管稳定，并通过自分泌LPA环路募集成纤维细胞和巨噬细胞来协调伤口愈合，从而维持增殖和细胞外基质（ECM）沉积。在肌肉再生中，损伤后ATX表达激增，通过LPA-WNT/β-catenin信号通路串扰促进卫星细胞融合，确保肌纤维肥大；而在免疫中，它影响B细胞迁移和血小板活化，从而促进血栓溶解。ATX缺乏会模拟血管缺陷并损害淋巴管生成，因此对于通过血浆LPA谱分析或在迁移室中使用中和抗体来研究体内趋化梯度至关重要。ATX过量产生通过CAF衍生的LPA刺激CTGF/TGF-β来驱动胰腺癌的间质增生；而在肺纤维化中，ATX-LPA维持肌成纤维细胞分化和TIF1沉积。这两种情况都揭示了对 ATX 抑制剂的治疗脆弱性，ATX 抑制剂可以破坏 LPA 信号传导，而不会产生毒性。 |
| 参考文献 |
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