EphA3/A4/A5 Antibody [A18J10]
目录号: F8255
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: MOLT-4, Lane 2: NIH/3T3
操作要点
WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
|---|
| WB, IP |
| 反应性 |
|---|
| Human, Mouse |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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135 kDa
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| 阳性对照 | SNB19 cells; MOLT-4 cells; mIMCD-3 cells; NIH/3T3 cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
|---|
实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| EphA3/A4/A5 Antibody [A18J10] 可检测内源性 EphA3, EphA4, 和 EphA5 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞膜，细胞突起，细胞外环境，细胞连接，内体，突触后膜，突触 |
| Uniprot ID |
|---|
| P54756; P29320; P54764 |
| 克隆号 |
|---|
| A18J10 |
| 别名 |
|---|
| Ephrin type-A receptor 3/4/5; EPHA3; EPHA4; EPHA5 |
| 背景 |
|---|
| EphA3/A4/A5受体属于Eph受体酪氨酸激酶家族，具体而言是EphA亚类，该亚类优先结合GPI锚定的ephrin-A配体，从而在发育过程中协调细胞间排斥和拓扑映射。这些受体共享一个胞外配体结合域、一个富含半胱氨酸的区域以及一个胞内激酶域，其中含有SAM和PDZ结合基序，可募集Nck和Crk等衔接蛋白进行信号传导。配体结合诱导受体聚集和自身磷酸化，激活PI3K-AKT和MAPK/ERK信号通路，并通过ephexin和Vav交换因子调节Rho GTP酶活性，进而驱动肌动蛋白细胞骨架收缩和伪足回缩，这对于接触排斥至关重要。 EphA3优先与ephrin-A5通过倾斜的高亲和力界面结合，其中ephrin的GH环插入受体口袋，稳定一种构象，与EphA2相比，这种构象增强了激酶的激活。EphA4和A5具有重叠的特异性，通过梯度信号精细调控视网膜-顶盖投射和胼胝体轴突导向。前向信号抑制AKT，从而在肿瘤环境中促进细胞凋亡和细胞周期阻滞；而激酶或配体结合域的体细胞突变会破坏这种抑癌功能，导致肺癌、结直肠癌和乳腺癌中不受控制的增殖和转移。EphA3调控心脏间充质迁移，而EphA4通过排斥信号协调后脑节段形成和血管模式形成，防止异常组织融合。通过失活突变导致的失调与肺癌进展和胃癌血管生成相关，而 EphA5 维持视网膜地形投射。 |
| 参考文献 |
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