γTubulin (Centrosome Marker) Antibody [D14G7]
目录号: F4845
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Hela, Lane 2: COS-7, Lane 3: Hepa1-6, Lane 4: CHO
操作要点
WB
建议一抗稀释比: 1:10000
建议一抗稀释比: 1:10000
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IF |
| 反应性 |
|---|
| Mouse, Chicken, Cow, Dog, Human, African green monkey, Chinese hamster |
| 抗体类型 |
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| Mouse Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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51 kDa
48 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | HeLa cells ; U87 cells ; COS7 cells; P19 cells Hepa1‑6 cells; CHO cells; MDBK cells; MDCK cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 Tris-Triton Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 Tris-Triton Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 Tris-Triton Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:10000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
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实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| γTubulin (Centrosome Marker) Antibody [D14G7] 可检测内源性 γTubulin (Centrosome Marker) 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞质，细胞骨架，微管 |
| Uniprot ID |
|---|
| P23258 |
| 克隆号 |
|---|
| D14G7 |
| 别名 |
|---|
| Gamma-tubulin 1; TUBG1; TUBG; Gamma-1-tubulin; GCP-1; Tubulin gamma-1 chain |
| 背景 |
|---|
| γ-微管蛋白属于微管蛋白家族，主要存在于真核生物的中心体中，是微管组织中心的核心组成部分。它组装成γ-微管蛋白环状复合物（γ-TuRC），该复合物呈环状结构，通过锚定微管的负端并促进α-β微管蛋白二聚体的单向聚合，决定了微管的13根原丝结构。这种成核活性不仅限于中心体，γ-TuRC还能沿微管晶格聚集，抑制微管灾变并增强正端稳定性，而无需进一步的成核作用。 γ-微管蛋白进一步组织成胞质γ-微管和核穿透γ-微管串，连接细胞器、线粒体、内体和染色质，促进结构完整性和定位，例如在有丝分裂过程中高尔基体带的形成和核膜在染色质周围的组装。SadB激酶在其C端核定位信号和螺旋-环-螺旋DNA结合基序附近的特定丝氨酸残基上进行磷酸化，触发G1-S期转换时的核转位，并在核内积累，抑制E2F转录活性，使APC/C-Cdh1失活，并与细胞周期蛋白E-Cdk2和Orc1一起协调中心体复制和DNA复制。在有丝分裂过程中，γ-微管蛋白募集至中心粒周围物质，与BRCA1、Chk2、ATR、Rad51等检查点蛋白以及抑癌基因p53和C53/Daox相互作用，同时与纤维中心外的核仁结合，从而在DNA损伤后调节G2/M期检查点的激活。这些相互作用将γ-微管蛋白与细胞周期调控、通过Rab11-内体维持纺锤体双极性、染色体分离以及胞质分裂的保真度联系起来。在包括乳腺癌、胶质瘤、胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤、骨髓瘤和非小细胞癌在内的多种肿瘤中，γ-微管蛋白表达升高和定位改变，这与中心体扩增、淋巴结转移、预后不良以及与RB1的相互调节相关，从而在RB1缺陷的情况下维持E2F驱动的细胞增殖。 TUBG1 基因的突变，例如 DNA 结合域中的 Leu387Pro 突变，与脑畸形（如平脑畸形和小头畸形）有关。 |
| 参考文献 |
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