GPNMB Antibody [J15J20]
目录号: F8918
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: SK-BR-3
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP, IHC |
| 反应性 |
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| Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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95 kDa, 120 kDa
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| 阳性对照 | Human non-small cell lung carcinoma; Human colon carcinoma; Human endometrioid adenocarcinoma; Human ovarian clear cell carcinoma; UACC-62 cells; SK-MEL-2 cells; SK-BR-3 cells; SK-MEL-28 cells |
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| 阴性对照 | UACC-62 cells (PNGaseF treated); LOX-IMVI cells; TK-10 cells |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 在 20 μL 样品中加入蛋白上样缓冲液，可直接冰上备用；或通过温度梯度（如37 ℃煮样、50 ℃煮样、70 ℃煮样、90 ℃煮样、100 ℃煮样）来确定最佳变性条件，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| GPNMB Antibody [J15J20] 可检测内源性 GPNMB 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
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| 细胞膜，内体，内膜系统 |
| Uniprot ID |
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| Q14956 |
| 克隆号 |
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| J15J20 |
| 别名 |
|---|
| Transmembrane glycoprotein NMB; Hematopoietic growth factor inducible neurokinin-1 type; GPNMB; HGFIN; NMB |
| 背景 |
|---|
| GPNMB，即糖蛋白非转移性黑色素瘤蛋白B，属于I型跨膜糖蛋白家族，在多种组织中发挥着细胞黏附、迁移和溶酶体动力学的多功能调节作用。它具有N端多囊肾病样结构域、RGD整合素结合基序、可切割的胞外结构域以及带有半ITAM基序的短胞质尾，该基序可募集信号转接蛋白。GPNMB主要定位于正常细胞的细胞内区室，但在癌细胞中会转移到质膜，在那里，ADAM10介导的胞外结构域脱落释放出可溶性GPNMB，后者与内皮整合素结合，触发VEGF/NRP-1信号通路、FAK激活和定向迁移，而这些对于血管生成至关重要。全长GPNMB通过其RGD基序与α5β1整合素结合，驱动PI3K/AKT/mTOR和ERK/MAPK信号通路，进而上调MMP-2/9促进基质重塑，并上调ZEB1促进上皮-间质转化。GPNMB沉默通过下调MMP-3和HIF1α抑制细胞增殖、侵袭和管状结构形成，同时促进细胞凋亡，揭示了其在肿瘤-基质相互作用中的核心作用。在胶质瘤和乳腺癌细胞中，GPNMB脱落的胞外结构域可募集内皮细胞支持血管拟态。GPNMB调控黑素体向角质形成细胞的转移、通过RANKL调控成骨细胞/破骨细胞分化以及通过与VCAM-1黏附促进树突状细胞成熟，使其成为研究溶酶体生物合成或组织修复模型中免疫细胞运输的重要靶点。它在皮肤、心脏、肾脏和肌肉中的表达通过自噬-溶酶体通量和碎片清除来维持体内平衡，其组织特异性脱落受HB-EGF/EGFR磷酸化调控。过度表达导致的失调与黑色素瘤、胶质瘤和三阴性乳腺癌的转移相关，其中表面定位预示着不良预后。 |
| 参考文献 |
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