GRK 4/5/6 Antibody [P12B19]

目录号: F4407

抗体应用：反应性：Human, Mouse, Rat

Lane 1: NIH/3T3

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
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使用信息

稀释比例

抗体应用
WB, IP

反应性
Human, Mouse, Rat

抗体类型
Mouse Monoclonal Antibody

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量
65-70kDa

阳性对照	NIH 3T3 cell
阴性对照

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:500），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:500），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
GRK 4/5/6 Antibody [P12B19] 可检测内源性 GRK 4/5/6 总蛋白水平。

蛋白定位
细胞质

Uniprot ID
P32298

克隆号
P12B19

别名
G protein-coupled receptor kinase 4; G protein-coupled receptor kinase GRK4; ITI1; GRK4; GPRK2L; GPRK4.

背景
G蛋白偶联受体 (GPCR) 是一个庞大的膜蛋白家族，通过激活多种细胞内第二信使系统介导细胞对多种细胞外配体的应答。受体信号传导的终止，尤其是同源脱敏，主要由 G 蛋白偶联受体激酶 (GRK) 及其辅因子 β-抑制蛋白控制。GRK 磷酸化配体占据的受体，从而促进 β-抑制蛋白募集，并促进受体内化和信号衰减。GRK 家族包含六种亚型 (GRK1-6)，每种亚型具有不同的调控特性和组织分布。其中，GRK4 表现出独特的特性：它以四种剪接变体（GRK4α、GRK4β、GRK4γ 和 GRK4δ）存在，并且与广泛跨组织表达的 GRK2、GRK3、GRK5 和 GRK6 不同，GRK4 的表达受到严格限制，据报道主要在睾丸中具有较高的转录本丰度。相比之下，GRK6 分布更广泛，特别是在免疫系统中，它在调节 GPCR 介导的反应中起着核心作用。GRK6 磷酸化趋化因子受体和其他免疫相关 GPCR，从而调节受体脱敏、运输和下游信号传导。其功能扩展到控制炎症过程、白细胞迁移和伤害感受信号传导。GRK6 失调与慢性炎症疾病有关，包括类风湿性关节炎和炎症性肠病。从机制上讲，GRK6 与 NF-κB 等转录网络相交叉，影响细胞因子的产生，调节活性氧信号传导，并有助于造血干细胞的维持。

背景

G蛋白偶联受体 (GPCR) 是一个庞大的膜蛋白家族，通过激活多种细胞内第二信使系统介导细胞对多种细胞外配体的应答。受体信号传导的终止，尤其是同源脱敏，主要由 G 蛋白偶联受体激酶 (GRK) 及其辅因子 β-抑制蛋白控制。GRK 磷酸化配体占据的受体，从而促进 β-抑制蛋白募集，并促进受体内化和信号衰减。GRK 家族包含六种亚型 (GRK1-6)，每种亚型具有不同的调控特性和组织分布。其中，GRK4 表现出独特的特性：它以四种剪接变体（GRK4α、GRK4β、GRK4γ 和 GRK4δ）存在，并且与广泛跨组织表达的 GRK2、GRK3、GRK5 和 GRK6 不同，GRK4 的表达受到严格限制，据报道主要在睾丸中具有较高的转录本丰度。相比之下，GRK6 分布更广泛，特别是在免疫系统中，它在调节 GPCR 介导的反应中起着核心作用。GRK6 磷酸化趋化因子受体和其他免疫相关 GPCR，从而调节受体脱敏、运输和下游信号传导。其功能扩展到控制炎症过程、白细胞迁移和伤害感受信号传导。GRK6 失调与慢性炎症疾病有关，包括类风湿性关节炎和炎症性肠病。从机制上讲，GRK6 与 NF-κB 等转录网络相交叉，影响细胞因子的产生，调节活性氧信号传导，并有助于造血干细胞的维持。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/9092566/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36555521/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%