GW182 Antibody [B20J19]

目录号: F4100

抗体应用：反应性：Human, Mouse, Monkey

Lane 1: Hela, Lane 2: U2OS, Lane 3: C2C12, Lane 4: Nuro-2a

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
400-668-6834 info@selleck.cn

操作要点

WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。

使用信息

稀释比例
WB1:1000 IP1:100

抗体应用
WB, IP

反应性
Human, Mouse, Monkey

抗体类型
Rabbit Monoclonal Antibody

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量
182 kDa, 220 kDa

阳性对照	HeLa cell; U-2 0S cell; C2C12 cell; Neuro-2a cell
阴性对照

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
GW182 Antibody [B20J19] 可检测内源性 GW182 总蛋白水平。

蛋白定位
细胞质

Uniprot ID
Q8NDV7

克隆号
B20J19

别名
Trinucleotide repeat-containing gene 6A protein; CAG repeat protein 26; EMSY interactor protein; GW182 autoantigen (Protein GW1); Glycine-tryptophan protein of 182 kDa; TNRC6A; CAGH26; KIAA1460; TNRC6

背景
GW182，又称TNRC6A，是GW182/TNRC6家族中的关键支架蛋白，参与microRNA（miRNA）介导的基因沉默，是miRNA诱导的沉默复合物（miRISC）的核心组分。它是一种分子量较大的蛋白质（约182 kDa），其序列中分布着多个甘氨酸-色氨酸（GW）重复序列，这些序列可直接与Argonaute（Ago）蛋白结合，从而促进miRISC的组装。GW182的C端附近还具有一个经典的RNA识别基序（RRM）；然而，结构研究表明，该RRM并不直接结合RNA，而是可能促进蛋白质-蛋白质相互作用，从而赋予基因沉默特异性。 GW182 将 Ago 蛋白与下游效应分子（例如 CCR4-NOT 脱腺苷酸酶复合物和 poly(A) 结合蛋白 (PABP)）连接起来，促进翻译抑制和靶 mRNA 的脱腺苷酸化/降解。该蛋白定位于细胞质加工小体 (P-bodies)，即 mRNA 的储存和降解位点，因此在转录后调控中发挥作用。GW182 至少具有两个抑制结构域，这两个结构域分别诱导翻译抑制和适度的 mRNA 降解，并通过其多结构域结构协调靶 mRNA 的沉默。

背景

GW182，又称TNRC6A，是GW182/TNRC6家族中的关键支架蛋白，参与microRNA（miRNA）介导的基因沉默，是miRNA诱导的沉默复合物（miRISC）的核心组分。它是一种分子量较大的蛋白质（约182 kDa），其序列中分布着多个甘氨酸-色氨酸（GW）重复序列，这些序列可直接与Argonaute（Ago）蛋白结合，从而促进miRISC的组装。GW182的C端附近还具有一个经典的RNA识别基序（RRM）；然而，结构研究表明，该RRM并不直接结合RNA，而是可能促进蛋白质-蛋白质相互作用，从而赋予基因沉默特异性。 GW182 将 Ago 蛋白与下游效应分子（例如 CCR4-NOT 脱腺苷酸酶复合物和 poly(A) 结合蛋白 (PABP)）连接起来，促进翻译抑制和靶 mRNA 的脱腺苷酸化/降解。该蛋白定位于细胞质加工小体 (P-bodies)，即 mRNA 的储存和降解位点，因此在转录后调控中发挥作用。GW182 至少具有两个抑制结构域，这两个结构域分别诱导翻译抑制和适度的 mRNA 降解，并通过其多结构域结构协调靶 mRNA 的沉默。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19295135/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19535464/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%