JARID1B Antibody [A10D8]

目录号: F4159

抗体应用：反应性：Human, Mouse, Monkey

Lane 1: MCF7, Lane 2: NCCIT, Lane 3: COS-7

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
400-668-6834 info@selleck.cn

操作要点

WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。

使用信息

稀释比例
WB1:1000 IP1:50 CHIP1:50

抗体应用
WB, IP, ChIP

反应性
Human, Mouse, Monkey

抗体类型
Rabbit Monoclonal Antibody

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量
180 kDa

阳性对照	MCF7 cell; NCCIT cell; COS-7 cell; K652 cell
阴性对照

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
JARID1B Antibody [A10D8] 可检测内源性 JARID1B 总蛋白水平。

蛋白定位
细胞核

Uniprot ID
Q9UGL1

克隆号
A10D8

别名
Lysine-specific demethylase 5B; Cancer/testis antigen 31 (CT31); Histone demethylase JARID1B; Jumonji/ARID domain-containing protein 1B; PLU-1; Retinoblastoma-binding protein 2 homolog 1 (RBP2-H1); [histone H3]-trimethyl-L-lysine(4) demethylase 5B; KDM5B; JARID1B; PLU1; RBBP2H1

背景
JARID1B，又名KDM5B或PLU-1，是一种组蛋白去甲基化酶，属于含Jumonji C (JmjC)结构域的蛋白家族，它通过去除组蛋白H3第4位赖氨酸（H3K4）的甲基来调控染色质结构和基因表达。它是一种多结构域酶，具有关键的保守区域，包括催化结构域JmjN和JmjC、富含AT的相互作用结构域（ARID）、C5HC2锌指以及多个植物同源结构域（PHD）。JmjN和JmjC结构域构成活性位点，负责去除H3K4上的三甲基、二甲基和单甲基，而ARID和锌指结构域则促进染色质结合。PHD1结构域特异性地结合未甲基化的H3K4，并在去甲基化后稳定抑制性染色质状态。 JARID1B通过压缩染色质和调节靶基因的可及性来抑制转录，并参与多种重要的生物学过程，包括细胞周期进程、胚胎发育、DNA损伤修复（通过募集Ku70和BRCA1等蛋白）以及通过调控发育基因和抑癌基因来决定细胞谱系。JARID1B在乳腺癌、前列腺癌和肺癌等癌症中经常过表达，促进肿瘤细胞增殖、迁移和耐药性；然而，在某些情况下，例如黑色素瘤，它也表现出抑癌活性。其酶活性依赖于保守的铁螯合残基（His-499、Glu-501和His-587），这些残基的突变会导致其功能丧失。

背景

JARID1B，又名KDM5B或PLU-1，是一种组蛋白去甲基化酶，属于含Jumonji C (JmjC)结构域的蛋白家族，它通过去除组蛋白H3第4位赖氨酸（H3K4）的甲基来调控染色质结构和基因表达。它是一种多结构域酶，具有关键的保守区域，包括催化结构域JmjN和JmjC、富含AT的相互作用结构域（ARID）、C5HC2锌指以及多个植物同源结构域（PHD）。JmjN和JmjC结构域构成活性位点，负责去除H3K4上的三甲基、二甲基和单甲基，而ARID和锌指结构域则促进染色质结合。PHD1结构域特异性地结合未甲基化的H3K4，并在去甲基化后稳定抑制性染色质状态。 JARID1B通过压缩染色质和调节靶基因的可及性来抑制转录，并参与多种重要的生物学过程，包括细胞周期进程、胚胎发育、DNA损伤修复（通过募集Ku70和BRCA1等蛋白）以及通过调控发育基因和抑癌基因来决定细胞谱系。JARID1B在乳腺癌、前列腺癌和肺癌等癌症中经常过表达，促进肿瘤细胞增殖、迁移和耐药性；然而，在某些情况下，例如黑色素瘤，它也表现出抑癌活性。其酶活性依赖于保守的铁螯合残基（His-499、Glu-501和His-587），这些残基的突变会导致其功能丧失。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18048344/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28958389/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%