Keratin 17/19 Antibody [L1M17]
目录号: F5017
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Hela, Lane 2: A549, Lane 3: A431
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IHC |
| 反应性 |
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| Human, Mouse, Rat, Monkey |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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48/41 kDa
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| 阳性对照 | Human breast carcinoma; Human colon carcinoma; HeLa cells; A549 cells; A431 cells |
|---|---|
| 阴性对照 | Jurkat cells |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
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| Keratin 17/19 Antibody [L1M17] 可检测内源性 Keratin 17/19 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 中间丝，角蛋白，细胞质 |
| Uniprot ID |
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| P08727; Q04695 |
| 克隆号 |
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| L1M17 |
| 别名 |
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| 39.1; 40-kDa keratin intermediate filament; CK-17; CK-19; CK19; cytokeratin 19; Cytokeratin-17; Cytokeratin-19; K17; K19; K1C17; K1C19; K1CS; keratin 17; KRT17; KRT19; MGC15366; PC; PC2; PCHC1 |
| 背景 |
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| 角蛋白 17 和 19 属于角蛋白家族，这是一类中间丝蛋白，能够增强上皮细胞的结构。其中，I 型酸性角蛋白（如 K17 (K9-K28)）与 II 型碱性角蛋白配对，形成坚韧的异二聚体。 K17 具有非螺旋状头部结构域（氨基酸残基 1-83）、长 α 螺旋杆状结构（84-392）和非螺旋状尾部结构（393-432），而 K19 则具有类似的卷曲螺旋结构，这种结构适应于简单的上皮细胞。K17 存在于基底角质形成细胞、毛囊、指甲和皮脂腺中，为细胞提供抵抗摩擦的机械弹性。在伤口愈合过程中，K17 通过 Akt/mTOR 信号通路促进角质形成细胞增殖，并在 Ser44 位点磷酸化后螯合 14-3-3σ，从而促进翻译和细胞生长。K17 还激活 STAT3 核转运，提高细胞周期蛋白 D1 的水平，促进修复性上皮细胞的过度增殖。在细胞核内，K17 重塑染色质，加工 RNA，并协调 DNA 损伤反应蛋白，例如 53BP1、DNA-PKcs 和 H2AX。 K19 标记肝脏、胰腺和胆管中的腺上皮，有助于维持分泌组织的结构完整性。两种角蛋白均可作为免疫组织化学标记物；K17 可识别基底样乳腺癌和鳞状细胞癌，而 K19 则标记乳腺、甲状腺和肺的腺癌。K17 过表达通过解除 p27KIP1 的抑制作用来促进肿瘤侵袭，加速 G1/S 期细胞周期转换。K17 突变会破坏丝状网络，导致先天性厚甲症（伴有疼痛性指甲营养不良）、掌跖角化症和皮脂囊肿。K17 水平升高可通过 NF-κB 通路和细胞因子释放促进炎症相关癌症的发生发展。K19 缺失会破坏单层上皮的稳定性，从而导致胆道和胰腺疾病。在转移过程中，循环肿瘤细胞上K17/19的表达预示着各种癌的预后不良。角蛋白网络在修复、增殖和恶性转化过程中动态重塑，同时保护上皮细胞免受应激损伤。 |
| 参考文献 |
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