Keratin K3/K76 Antibody [A4J6]

目录号: F4390

抗体应用：反应性：human, mouse, bovine, rabbit

Lane 1: Mouse eyes

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
400-668-6834 info@selleck.cn

使用信息

稀释比例
WB1:500 IHC1:50

抗体应用
WB, IHC

反应性
human, mouse, bovine, rabbit

抗体类型
Mouse Monoclonal Antibody

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量
64 kDa

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:500），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:500），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

IHC
实验步骤：脱蜡/补液 1. 脱蜡/水合切片： 2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。 3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。 4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。 5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。 6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾；在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。在工作台上冷却玻片 30 分钟。染色 1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。 2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。 3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。 4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。 5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。 6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。 7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。 8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。在加湿室中室温孵育 30 分钟。 9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。 10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。 11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。 12. 将载玻片浸入 dH2O 中。 13. 如果需要，用苏木精复染切片。 14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。 15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒；在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒；在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。 16. 用盖玻片和封固剂封固切片。

IHC

实验步骤：

脱蜡/补液

1. 脱蜡/水合切片：

2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。

3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。

4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。

5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。

6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾；在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。在工作台上冷却玻片 30 分钟。

染色

1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。

2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。

3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。

4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。

5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。

6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。

7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。

8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。在加湿室中室温孵育 30 分钟。

9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。

10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。

11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。

12. 将载玻片浸入 dH2O 中。

13. 如果需要，用苏木精复染切片。

14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。

15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒；在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒；在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。

16. 用盖玻片和封固剂封固切片。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
Keratin K3/K76 Antibody [A4J6] 可检测内源性 Keratin K3/K76 总蛋白水平。

蛋白定位
中间丝，角蛋白

Uniprot ID
P12035; Q01546

克隆号
A4J6

别名
Keratin, type II cytoskeletal 3; 65 kDa cytokeratin; Cytokeratin-3 (CK-3); Keratin-3 (K3); Type-II keratin Kb3; KRT3; Keratin, type II cytoskeletal 2 oral; Cytokeratin-2P (CK-2P; K2P); Keratin-76 (K76); Type-II keratin Kb9; KRT76; KRT2B; KRT2P

背景
角蛋白K3/K76（细胞角蛋白3或KRT3）是中间丝超家族的II型碱性细胞角蛋白，主要表达于角膜上皮细胞。它与I型K12形成必需的异二聚体，提供机械弹性和结构支撑。K3/K76由一个中央α螺旋杆状结构域（亚结构域1A、1B、2A、2B）和两侧的非螺旋N端头部及C端尾部结构域组成，使其能够形成卷曲螺旋二聚体、原丝四聚体，并组装成10 nm的中间丝。这些中间丝锚定于桥粒和半桥粒，增强角膜上皮基底层上方的细胞层，使其免受剪切应力、干燥和创伤的影响，从而维持角膜（主要部位）等复层上皮组织（以及在较小程度上，食管）的屏障完整性和组织稳态。在角膜上皮细胞中，K3/K76的表达与细胞分化密切相关。K3基因突变破坏了丝状结构的组装，导致梅斯曼角膜营养不良，其特征是上皮脆弱、微囊形成以及由于细胞骨架完整性受损而引起的视力丧失。

背景

角蛋白K3/K76（细胞角蛋白3或KRT3）是中间丝超家族的II型碱性细胞角蛋白，主要表达于角膜上皮细胞。它与I型K12形成必需的异二聚体，提供机械弹性和结构支撑。K3/K76由一个中央α螺旋杆状结构域（亚结构域1A、1B、2A、2B）和两侧的非螺旋N端头部及C端尾部结构域组成，使其能够形成卷曲螺旋二聚体、原丝四聚体，并组装成10 nm的中间丝。这些中间丝锚定于桥粒和半桥粒，增强角膜上皮基底层上方的细胞层，使其免受剪切应力、干燥和创伤的影响，从而维持角膜（主要部位）等复层上皮组织（以及在较小程度上，食管）的屏障完整性和组织稳态。在角膜上皮细胞中，K3/K76的表达与细胞分化密切相关。K3基因突变破坏了丝状结构的组装，导致梅斯曼角膜营养不良，其特征是上皮脆弱、微囊形成以及由于细胞骨架完整性受损而引起的视力丧失。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/2424919/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26788030/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%