LPCAT3 Antibody [H3J6]
目录号: F5095
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Karpas-299, Lane 2: HepG2
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IHC, ELISA |
| 反应性 |
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| Human, Pig |
| 抗体类型 |
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| Mouse Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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56 kDa
56 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Pig stomach tissue; Human stomach tissue; HepG2 cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
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| LPCAT3 Antibody [H3J6] 可检测内源性 LPCAT3 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
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| 内质网，内膜系统 |
| Uniprot ID |
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| Q6P1A2 |
| 克隆号 |
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| H3J6 |
| 别名 |
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| Lysophospholipid acyltransferase 5; LPLAT 5; EC:2.3.1.23; EC:2.3.1.n7; EC:2.3.1.n6; LPCAT; LPSAT; LPCAT3; MBOAT5; OACT5 |
| 背景 |
|---|
| LPCAT3（溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶3）是LPCAT家族溶血磷脂酰基转移酶的关键酶，主要存在于肝脏、肠道和脂肪组织等代谢组织的内质网中。它选择性地用花生四烯酸和亚油酸等多不饱和脂肪酸酰化溶血磷脂酰胆碱，生成易过氧化的磷脂酰胆碱。其膜结合结构具有多个跨膜结构域，这些结构域将活性位点定位在内质网双层膜内，以便脂质底物进入。在脂质过载的情况下，LPCAT3通过LXR/PPARγ核受体信号通路被激活，驱动LPCAT3将花生四烯酰辅酶A掺入膜磷脂中，从而使含多不饱和脂肪酸的磷脂酰乙醇胺（PUFA-PE）在铁死亡执行阶段更容易被15-脂氧合酶氧化。这与ACSL4-LPCAT3-15LOX轴相整合。在该轴中，LPCAT3敲低可通过抑制脂质过氧化底物来部分挽救铁死亡，而其通过YAP/TEAD-ZEB1转录上调则增强EP300介导的LPCAT3启动子处H3K27乙酰化，从而放大癌细胞对铁死亡的敏感性。LPCAT3通过磷脂去饱和来维持内质网膜的流动性，减轻营养过剩时饱和脂肪酸引起的脂毒性应激，从而平衡分解代谢脂质重塑与铁死亡检查点。生理上，这种双重性调控着肠道脂质吸收、肝脏脂蛋白分泌和巨噬细胞吞噬作用，使LPCAT3成为研究人员在脂质组学筛选中构建铁死亡动力学模型或在非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）类器官中解析内质网稳态的关键因素。过表达与肺腺癌和急性髓系白血病预后不良相关，其机制是通过逃避铁死亡和免疫抑制；而缺乏则会导致脂肪性肝炎。 |
| 参考文献 |
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