NCK1 Antibody [M17H23]

目录号: F1255

抗体应用：反应性：Human, Mouse, Rat, Monkey

Lane 1: A10
Lane 2: 293
Lane 3: COS
Lane 4: NIH/3T3

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
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使用信息

稀释比例
WB1:1000 IP1:50

抗体应用
WB, IP

反应性
Human, Mouse, Rat, Monkey

抗体类型
Rabbit Monoclonal Antibody

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN₃

储存条件(自收到货起)
–20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量
47 Kda

阳性对照	293; A10; NIH/3T3; COS
阴性对照

实验方法

WB
Western Blotting 样品制备 1. 吸去培养基,用1X PBS清洗细胞。 2. 加入1X SDS上样缓冲液裂解细胞,将提取物转移至微量离心管中。置于冰上。 3. 超声10–15秒,完成细胞裂解和DNA剪切。 4. 将20 µl样品在95–100°C加热5分钟,然后置于冰上冷却。 5. 离心5分钟(使用微量离心机)。 6. 将适量样品上样至SDS-PAGE凝胶(上样量取决于提取蛋白浓度)。注意:同时请上样预染分子量标准,以确定分子量并验证电转效果。 7. 电转至硝酸纤维素膜/PVDF膜。膜封闭与抗体孵育 a. 封闭 1. (可选)转膜完成后,用TBS室温洗膜5分钟。 2. 将膜在封闭液中室温孵育1小时。 3. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。 b. 抗体孵育 1. 将膜与一抗(按推荐的稀释度和稀释液配制)置于一抗稀释缓冲液中,4°C温和摇床过夜孵育。 2. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。 3. 将膜与适当的二抗(稀释于封闭液中)在室温下温和摇床孵育1小时。 4. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。 5. 进行检测。显影检测 1. 抗体孵育结束后,用TBST洗膜3次,每次5分钟。 2. 配制ECL发光试剂(或根据二抗类型选择其他显色剂/底物)。混匀。 3. 将底物与膜孵育1分钟,去除多余溶液(膜保持湿润),置于显影仪中进行曝光。

Western Blotting

样品制备

1. 吸去培养基,用1X PBS清洗细胞。

2. 加入1X SDS上样缓冲液裂解细胞,将提取物转移至微量离心管中。置于冰上。

3. 超声10–15秒,完成细胞裂解和DNA剪切。

4. 将20 µl样品在95–100°C加热5分钟,然后置于冰上冷却。

5. 离心5分钟(使用微量离心机)。

6. 将适量样品上样至SDS-PAGE凝胶(上样量取决于提取蛋白浓度)。注意:同时请上样预染分子量标准,以确定分子量并验证电转效果。

7. 电转至硝酸纤维素膜/PVDF膜。

膜封闭与抗体孵育

a. 封闭

1. (可选)转膜完成后,用TBS室温洗膜5分钟。

2. 将膜在封闭液中室温孵育1小时。

3. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。

b. 抗体孵育

1. 将膜与一抗(按推荐的稀释度和稀释液配制)置于一抗稀释缓冲液中,4°C温和摇床过夜孵育。

2. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。

3. 将膜与适当的二抗(稀释于封闭液中)在室温下温和摇床孵育1小时。

4. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。

5. 进行检测。

显影检测

1. 抗体孵育结束后,用TBST洗膜3次,每次5分钟。

2. 配制ECL发光试剂(或根据二抗类型选择其他显色剂/底物)。混匀。

3. 将底物与膜孵育1分钟,去除多余溶液(膜保持湿润),置于显影仪中进行曝光。

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 将细胞转移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声破碎，冰上静置裂解 30 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 将细胞转移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声破碎，冰上静置裂解 30 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
NCK1 Antibody [M17H23] 检测内源性NCK1总蛋白水平。基于同源性，它也可能识别NCK2。

蛋白定位
细胞质，内质网，细胞核

Uniprot ID
P16333

克隆号
M17H23

别名
Nck,NCK1

背景
Nck1是一种重要的神经元接头分子，在介导突触分子活动、调节肌动蛋白细胞骨架、影响神经元功能等方面发挥着重要作用。它是Nck接子家族的一部分，包括Nck1/α和Nck2/β，是细胞表面pTyr信号传导和肌动蛋白细胞骨架调控所必需的。Nck1由一个SH2和三个SH3结构域组成，它们在聚集和肌动蛋白聚合中起关键作用，对细胞事件如形态发生和传递至关重要。Nck1通过调节外侧杏仁核兴奋性神经元的谷氨酸释放参与恐惧记忆的形成，从而影响长期恐惧条件反射记忆。它在突触结构和功能的形成中也起着至关重要的作用。Nck1缺乏与海马树突棘密度降低和突触后密度(PSD)厚度增加有关。此外，它通过Rac1/PAK1/MMP2信号通路促进宫颈鳞状细胞癌(CSCC)的血管生成。NCK1过表达与卵巢癌侵袭性和不良预后相关。

背景

Nck1是一种重要的神经元接头分子，在介导突触分子活动、调节肌动蛋白细胞骨架、影响神经元功能等方面发挥着重要作用。它是Nck接子家族的一部分，包括Nck1/α和Nck2/β，是细胞表面pTyr信号传导和肌动蛋白细胞骨架调控所必需的。Nck1由一个SH2和三个SH3结构域组成，它们在聚集和肌动蛋白聚合中起关键作用，对细胞事件如形态发生和传递至关重要。Nck1通过调节外侧杏仁核兴奋性神经元的谷氨酸释放参与恐惧记忆的形成，从而影响长期恐惧条件反射记忆。它在突触结构和功能的形成中也起着至关重要的作用。Nck1缺乏与海马树突棘密度降低和突触后密度(PSD)厚度增加有关。此外，它通过Rac1/PAK1/MMP2信号通路促进宫颈鳞状细胞癌(CSCC)的血管生成。NCK1过表达与卵巢癌侵袭性和不良预后相关。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36371406/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36535770/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%