NDUFB8 Antibody [B17H14]
目录号: F7840
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: HCT116, Lane 2: SW480, Lane 3: RAW264.7, Lane 4: H-4-II-E
操作要点
WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min，建议使用 0.22 μm PVDF膜。
湿转参考条件：200 mA, 60 min，建议使用 0.22 μm PVDF膜。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
|---|
| WB |
| 反应性 |
|---|
| Human, Mouse, Rat |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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19 kDa
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| 阳性对照 | Mouse brain; Rat brain; HCT‑116 cells; NCI‑H460 cells; SW480 cells; HCC1187 cells; RAW 264.7 cells; H‑4‑II‑E cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.22 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| NDUFB8 Antibody [B17H14] 可检测内源性 NDUFB8 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 内膜系统，线粒体，线粒体内膜 |
| Uniprot ID |
|---|
| O95169 |
| 克隆号 |
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| B17H14 |
| 别名 |
|---|
| NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 beta subcomplex subunit 8, mitochondrial; Complex I-AS8L; CI-AS8L; NADH-ubiquinone oxidoreductase B18 subunit; NDUFB8 |
| 背景 |
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| NDUFB8 是线粒体呼吸链复合物 I（NADH：泛醌氧化还原酶）中的一个辅助亚基。复合物 I 是一个大型的 L 形结构，由核心亚基和额外的亚基组成，横跨线粒体内膜，促进电子从 NADH 传递至泛醌，同时将质子泵入膜间隙。NDUFB8 位于靠近铁硫簇的基质突出亲水臂上，并整合到外周臂结构中，稳定泛醌还原发生的 Q 模块，并支持质子转运途径所必需的整体结构。该亚基通过协调铁硫 (FeS) 亚复合物的组装直接参与复合物 I 的生物合成，从而实现 FeS 簇的顺序整合，这些 FeS 簇沿着电子传递链从 FMN 传递至 Q 位点。NDUFB8 的缺失会破坏复合物 I 的后期成熟，导致酶活性丧失。 NDUFB8 的酪氨酸硝化作用会触发涉及 RIP1 和 RIP3 激酶的信号级联反应，通过坏死体的形成将细胞命运从凋亡转变为程序性坏死，从而加剧线粒体损伤并释放活性氧。它维持着脑和肌肉等高能量需求组织中的氧化磷酸化效率，在这些组织中，复合物 I 的活性将营养物质氧化与 ATP 合成偶联，并在底物可用性变化的情况下调节代谢通量。NDUFB8 的致病性双等位基因变异会导致孤立性复合物 I 缺陷，表现为类似 Leigh 脑肌病，其特征是基底神经节病变、肌张力低下以及由于电子传递受损和能量衰竭引起的乳酸性酸中毒。 |
| 参考文献 |
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