Neurofilament-M/H Antibody (Mouse mAb) [G10L12]
目录号: F4382
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: 293T, Lane 2: SH-SY5Y -
Immunofluorescent analysis of Mouse brain tissue using F4382 (green, 1:100), Hoechst (blue) and tubulin (Red).
操作要点
WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IHC, IF |
| 反应性 |
|---|
| Human, Mouse, Rat |
| 抗体类型 |
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| Mouse Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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102 kDa
160 kDa, 200 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Rat lumbar dorsal root ganglion; HEK-293T cells; HeLa cells; SH-SY5Y cells; SK-N-SH cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 Tris-Triton Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 Tris-Triton Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 Tris-Triton Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
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实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| Neurofilament-M/H Antibody (Mouse mAb) [G10L12] 可检测内源性 Neurofilament-M/H 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞突起，细胞质，细胞骨架 |
| Uniprot ID |
|---|
| P07197, P12036 |
| 克隆号 |
|---|
| G10L12 |
| 别名 |
|---|
| Neurofilament medium polypeptide, NF-M, 160 kDa neurofilament protein, Neurofilament 3, Neurofilament triplet M protein, NEFM, NEF3, NFM |
| 背景 |
|---|
| 神经丝蛋白M和神经丝蛋白H是神经元特异性的IV型中间丝亚基，它们与神经丝蛋白L和α-中间丝蛋白组装成10纳米的异聚体，构成大型有髓轴突的主要细胞骨架系统。在有髓轴突中，它们调节轴突直径，并有助于长投射神经元的机械稳定性和传导特性。每个亚基都包含一个保守的中央α螺旋杆状结构域，该结构域驱动卷曲螺旋二聚体的形成和丝状体的组装，其两侧分别是N端头部和延伸的C端尾部；NF-M和NF-H的区别在于其具有从丝状体核心向两侧延伸的长而固有无序的尾部结构域，这些结构域富含赖氨酸-丝氨酸-脯氨酸（KSP）重复序列，这些序列是多激酶磷酸化的主要位点。 NF-M 和 NF-H 的富含 KSP 的尾部可被多种激酶磷酸化，包括 PKA、PKC、Cdk5、ERK、GSK-3、SAPK 和 PKN。这种翻译后修饰能够调节神经丝间距、与微管和肌动蛋白的相互作用以及抗蛋白水解能力，从而调节轴突内神经丝的堆积密度，并稳定成熟轴突上的固定神经丝网络。NF-H 和 NF-M C 端尾部结构域的缺失或截短会降低视神经轴突上的稳态神经丝含量，而不会改变亚基合成或减慢轴突运输速率，并加速神经丝从固定细胞骨架上的清除。这表明，这些尾部结构域通过抑制神经丝的周转而非调节运输来维持神经丝水平。 NF-M 和 NF-H 通过决定神经丝的数量和间距及其横桥相互作用，促进有髓轴突的径向生长和维持其直径，并影响传导速度；同时，它们还通过物理关联和共享的调控激酶影响其他细胞骨架成分（如微管）的动力学和功能。包括 NF-M 和 NF-H 在内的神经丝亚基主要在神经元中表达，其丰度具有区域和直径依赖性，并且其磷酸化状态沿轴突呈现近端-远端梯度，该梯度与轴突的成熟、髓鞘形成和节段特异性机械需求相关。神经丝轻链/重链（NF-M/H）表达、尾部磷酸化或周转的紊乱在神经退行性疾病中十分常见。肌萎缩侧索硬化症、帕金森病和阿尔茨海默病中均观察到神经丝mRNA下调以及紊乱或聚集的神经丝积累。紊乱的神经丝束干扰轴突运输被认为是导致选择性轴突和神经元丢失的机制之一。脑脊液和血液中神经丝蛋白及其磷酸化片段水平升高可作为多种运动神经元疾病和神经退行性疾病中轴突损伤和疾病进展的生物标志物。 |
| 参考文献 |
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