NMDA Receptor 2B/GluN2B Antibody [K20B17]

目录号: F0550

抗体应用：反应性：Human, Mouse, Rat

Lane 1: Mouse brain, Lane 2: Neonatal mouse brain

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
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操作要点

WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。

使用信息

稀释比例
WB1:1000

抗体应用
WB

反应性
Human, Mouse, Rat

抗体类型
Rabbit Monoclonal Antibody

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量
190 kDa

阳性对照	Mouse brain; Neonatal mouse brain
阴性对照

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
NMDA Receptor 2B/GluN2B Antibody [K20B17] 可检测内源性 NMDA Receptor 2B/GluN2B 总蛋白水平。

蛋白定位
细胞膜，细胞突起，细胞质，细胞骨架，内体，溶酶体，内膜系统，突触后膜，突触

Uniprot ID
Q13224

克隆号
K20B17

别名
Glutamate receptor ionotropic, NMDA 2B; GluN2B; Glutamate [NMDA] receptor subunit epsilon-2; N-methyl D-aspartate receptor subtype 2B (NMDAR2B; NR2B); N-methyl-D-aspartate receptor subunit 3 (NR3; hNR3); GRIN2B; NMDAR2B

背景
NMDA受体2B (GluN2B) 是谷氨酸结合亚基，对功能性NMDA受体的组装至关重要。NMDA受体是异源四聚体配体门控阳离子通道，通常由两个GluN1亚基和两个GluN2亚基组成。每个亚基都包含一个胞外氨基末端结构域 (NTD) 和配体结合结构域 (LBD)、一个形成离子传导孔的跨膜结构域 (TMD) 以及一个受调控性磷酸化的胞内C末端结构域 (CTD)。NMDA受体的激活需要谷氨酸同时结合GluN2B的LBD，甘氨酸或D-丝氨酸同时结合GluN1，并且需要膜去极化以解除Mg²⁺阻滞。配体结合诱导配体结合域（LBD）闭合，并通过跨膜结构域（TMD）传递构象变化，从而打开通道，允许Na⁺、K⁺，尤其是Ca²⁺内流。含GluN2B亚基的受体在早期神经发育和突触外位点尤为突出，它们能够促进突触可塑性过程，例如长时程增强（LTP）。Src家族激酶对GluN2B在Tyr1472位点的磷酸化增强了Ca²⁺的通透性，并将受体激活与CaMKII介导的棘突重塑和记忆形成相偶联。虽然GluN2B驱动的信号传导对神经发育和学习至关重要，但其过度激活与兴奋性毒性神经退行性疾病有关，例如阿尔茨海默病、帕金森病、中风和慢性疼痛，在这些疾病中，过量的Ca²⁺内流会触发细胞死亡通路。

背景

NMDA受体2B (GluN2B) 是谷氨酸结合亚基，对功能性NMDA受体的组装至关重要。NMDA受体是异源四聚体配体门控阳离子通道，通常由两个GluN1亚基和两个GluN2亚基组成。每个亚基都包含一个胞外氨基末端结构域 (NTD) 和配体结合结构域 (LBD)、一个形成离子传导孔的跨膜结构域 (TMD) 以及一个受调控性磷酸化的胞内C末端结构域 (CTD)。NMDA受体的激活需要谷氨酸同时结合GluN2B的LBD，甘氨酸或D-丝氨酸同时结合GluN1，并且需要膜去极化以解除Mg²⁺阻滞。配体结合诱导配体结合域（LBD）闭合，并通过跨膜结构域（TMD）传递构象变化，从而打开通道，允许Na⁺、K⁺，尤其是Ca²⁺内流。含GluN2B亚基的受体在早期神经发育和突触外位点尤为突出，它们能够促进突触可塑性过程，例如长时程增强（LTP）。Src家族激酶对GluN2B在Tyr1472位点的磷酸化增强了Ca²⁺的通透性，并将受体激活与CaMKII介导的棘突重塑和记忆形成相偶联。虽然GluN2B驱动的信号传导对神经发育和学习至关重要，但其过度激活与兴奋性毒性神经退行性疾病有关，例如阿尔茨海默病、帕金森病、中风和慢性疼痛，在这些疾病中，过量的Ca²⁺内流会触发细胞死亡通路。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37324591/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30037851/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%