NPRL2 Antibody [L19L7]

目录号: F8198

抗体应用：反应性：Human, Mouse, Rat, Monkey

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
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使用信息

稀释比例
WB1:1000 IP1:50

抗体应用
WB, IP

反应性
Human, Mouse, Rat, Monkey

抗体类型
Rabbit Monoclonal Antibody

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量
41 kDa

阳性对照	LNCaP cells; DLD-1 cells; MCF-7 cells; IGROV-1 cells
阴性对照

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
NPRL2 Antibody [L19L7] 可检测内源性 NPRL2 总蛋白水平。

蛋白定位
溶酶体，内膜系统

Uniprot ID
Q8WTW4

克隆号
L19L7

别名
GATOR1 complex protein NPRL2; Gene 21 protein 1 publication (G21 protein); Nitrogen permease regulator 2-like protein (NPR2-like protein); Tumor suppressor candidate 4; NPRL2; TUSC4

背景
NPRL2（又名TUSC4）是GATOR1复合物（与DEPDC5和NPRL3组成）的核心组分，它作为RagA/B GTP酶的GAP（GTP酶激活蛋白），发挥mTORC1信号传导的负调控作用，从而在营养限制条件下抑制氨基酸诱导的mTORC1向溶酶体的转位，进而抑制蛋白质合成等合成代谢过程。NPRL2具有一个N端Longin结构域（残基~1-180），用于结合Rag GTP酶并发挥GAP活性；一个中央螺旋结构域，促进DEPDC5/NPRL3异二聚化；以及一个C端区域，使其能够与溶酶体膜结合并选择性地与Raptor相互作用。 Longin结构域中的关键残基（例如保守的Arg/Lys基序，特别是Arg78）催化RagA GDP/RagD GTP异二聚体上的GTP水解。在氨基酸充足的情况下，NPRL2与Raptor相互作用，通过“跷跷板”机制微调mTORC1的激活，在解除Rag抑制的同时防止过度激活；而当氨基酸缺乏时，NPRL2与Rag的结合会增强mTORC1的抑制作用，从而维持代谢稳态。NPRL2过表达通过维持BRCA1的稳定性并诱导NOX2/线粒体功能障碍产生ROS来抑制细胞增殖，进而触发p53功能正常细胞的DNA损伤反应和凋亡。NPRL2确保神经代谢平衡（例如，调节神经元中钠通道的表达），防止应激条件下的过度生长，并作为肿瘤抑制因子限制mTORC1驱动的肿瘤发生。致病性种系突变导致家族性局灶性癫痫和 mTOR 病（例如皮质发育不良），这是由于 mTORC1 过度活跃所致；而体细胞缺失则促进肿瘤发生。

背景

NPRL2（又名TUSC4）是GATOR1复合物（与DEPDC5和NPRL3组成）的核心组分，它作为RagA/B GTP酶的GAP（GTP酶激活蛋白），发挥mTORC1信号传导的负调控作用，从而在营养限制条件下抑制氨基酸诱导的mTORC1向溶酶体的转位，进而抑制蛋白质合成等合成代谢过程。NPRL2具有一个N端Longin结构域（残基~1-180），用于结合Rag GTP酶并发挥GAP活性；一个中央螺旋结构域，促进DEPDC5/NPRL3异二聚化；以及一个C端区域，使其能够与溶酶体膜结合并选择性地与Raptor相互作用。 Longin结构域中的关键残基（例如保守的Arg/Lys基序，特别是Arg78）催化RagA GDP/RagD GTP异二聚体上的GTP水解。在氨基酸充足的情况下，NPRL2与Raptor相互作用，通过“跷跷板”机制微调mTORC1的激活，在解除Rag抑制的同时防止过度激活；而当氨基酸缺乏时，NPRL2与Rag的结合会增强mTORC1的抑制作用，从而维持代谢稳态。NPRL2过表达通过维持BRCA1的稳定性并诱导NOX2/线粒体功能障碍产生ROS来抑制细胞增殖，进而触发p53功能正常细胞的DNA损伤反应和凋亡。NPRL2确保神经代谢平衡（例如，调节神经元中钠通道的表达），防止应激条件下的过度生长，并作为肿瘤抑制因子限制mTORC1驱动的肿瘤发生。致病性种系突变导致家族性局灶性癫痫和 mTOR 病（例如皮质发育不良），这是由于 mTORC1 过度活跃所致；而体细胞缺失则促进肿瘤发生。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38963491/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35165201/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%