OS9 Antibody [M17H4]
目录号: F7512
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: HL60, Lane 2: MCF7, Lane 3: PANC1, Lane 4: COS-7
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP |
| 反应性 |
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| Human, Mouse, Rat, Monkey |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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83 kDa,97 kDa
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| 阳性对照 | HeLa cells (thapsigargin, 2 nM, 16 h); SJSA‑1 cells; RH30 cells; HL‑60 cells; A‑431 cells; SN‑12C cells; MCF7 cells; ACHN cells; PANC‑1 cells; COLO 205 cells; COS‑7 cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| OS9 Antibody [M17H4] 可检测内源性 OS9 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
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| 内质网 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q13438 |
| 克隆号 |
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| M17H4 |
| 别名 |
|---|
| Protein OS-9; ER-retained protein; OS9 |
| 背景 |
|---|
| OS9 是一种内质网驻留凝集素，属于甘露糖-6-磷酸受体同源结构域家族，它识别错误折叠糖蛋白上的单糖基化 N-聚糖，从而促进内质网相关降解。该蛋白包含一个 N 端信号序列、一个中央 MRH 结构域（其甘露糖结合位点两侧为保守的带电残基）以及 C 端跨膜区和胞质尾区，这些区域使其锚定于内质网膜，并使其能够与易位机制相互作用。OS9 通过其 MRH 凝集素结构域结合末端错误折叠蛋白上的高甘露糖寡糖，并通过与 SEL1L 的直接相互作用将其募集到 Hrd1-SEL1L E3 泛素连接酶复合物，从而将底物递送至易位通道，使其逆转位至胞质溶胶，最终被蛋白酶体降解。结合特异性源于MRH结构域内的钙离子配位，该配位作用使甘露糖残基定位以便识别，从而在钙网蛋白/钙网蛋白循环的糖基化过程中区分错误折叠的构象异构体和正确折叠的糖蛋白。OS9与XTP3-B形成稳定的复合物，通过暴露疏水斑块增强对非糖基化底物的识别。同时，在急性内质网应激期间，IRE1/XBP1通路激活可转录上调两种OS9亚型，从而增强其降解能力。该蛋白与ERGIC-53和VIP36货物受体共定位，以阻止末端错误折叠的α1-抗胰蛋白酶变体和香港缺失变体的顺行运输。OS9缺陷会损害不稳定的CFTR折叠突变体和蓖麻毒素A链的降解，导致其在胞质中积累。 OS9 的亚型特异性表达模式是通过选择性剪接产生的，其中 OS9.1 在成纤维细胞中占主导地位，而 OS9.2 在专业分泌细胞中富集。OS9 的失调与先天性糖基化障碍和蛋白质折叠疾病（包括 α1-抗胰蛋白酶缺乏症）有关。 |
| 参考文献 |
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