OTUB1 Antibody [F10D20]

目录号: F1102

抗体应用：反应性：Mouse, Rat, Human

Lane 1: Hela, Lane 2: Hela (KO OTUB1), Lane 3: Mouse heart, Lane 4: Rat heart

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
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操作要点

WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。

使用信息

稀释比例
WB1:1000 - 1:10000 IP1:10 - 1:100

抗体应用
WB, IP

反应性
Mouse, Rat, Human

抗体类型
Rabbit Monoclonal Antibody

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量实际分子量
31 kDa 31 kDa, 35 kDa, 130 kDa
^*为什么预测分子量和实际分子量会有不同？以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。

阳性对照	Mouse heart whole tissue; Rat heart whole tissue; HeLa cell; HepG2 cell; 293T cell; MCF7 cell; HAP1 cell; HEK-293T cell
阴性对照

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 60 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 60 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
OTUB1 Antibody [F10D20] 可检测内源性 OTUB1 总蛋白水平。

蛋白定位
细胞质

Uniprot ID
Q96FW1

克隆号
F10D20

别名
OTB1; OTU1; HSPC263; OTUB1; Ubiquitin thioesterase OTUB1; Deubiquitinating enzyme OTUB1; OTU domain-containing ubiquitin aldehyde-binding protein 1; Otubain-1; Ubiquitin-specific-processing protease OTUB1; Hotu1

背景
OTUB1 是 OTU（卵巢肿瘤）结构域去泛素酶家族的成员，它通过切割泛素链来调控蛋白质泛素化，主要特异性地切割 K48 连接的多聚泛素链，并且能够去除 NEDD8 缀合物，但不能去除 SUMO 或 ISG15 缀合物。OTUB1 包含一个催化性的 OTU 结构域，该结构域具有一个保守的三联体，由半胱氨酸 91、组氨酸 265 和天冬氨酸 267 组成，这对其蛋白酶活性至关重要。此外，OTUB1 还具有一个延伸的 N 端 α 螺旋，该螺旋与近端泛素接触并抑制 E2 泛素结合酶，从而发挥除去泛素酶功能之外的调控作用。 OTUB1 存在两种由选择性剪接产生的亚型：一种是普遍表达的较短的 31 kDa 亚型，另一种是表达更为局限的较长的 35 kDa 亚型，主要在淋巴器官中表达。OTUB1 在细胞过程中发挥多种作用，包括通过抑制 E2 酶 UBE2N 的活性来修复 DNA 损伤、调节免疫以及通过抑制 MDM2 催化的泛素化来调节 p53 的稳定性，而这种调节通常与其去泛素化酶活性无关。OTUB1 还通过与 mTORC1 的关键组分 RAPTOR 相互作用并稳定 RAPTOR 来调节营养信号通路，从而影响癌细胞的存活和耐药性。OTUB1 在酪氨酸 26 位的磷酸化是 RAPTOR 相互作用和 mTORC1 激活的关键，这提示在肾癌中存在一条新的 Src-OTUB1-mTORC1 轴。

背景

OTUB1 是 OTU（卵巢肿瘤）结构域去泛素酶家族的成员，它通过切割泛素链来调控蛋白质泛素化，主要特异性地切割 K48 连接的多聚泛素链，并且能够去除 NEDD8 缀合物，但不能去除 SUMO 或 ISG15 缀合物。OTUB1 包含一个催化性的 OTU 结构域，该结构域具有一个保守的三联体，由半胱氨酸 91、组氨酸 265 和天冬氨酸 267 组成，这对其蛋白酶活性至关重要。此外，OTUB1 还具有一个延伸的 N 端 α 螺旋，该螺旋与近端泛素接触并抑制 E2 泛素结合酶，从而发挥除去泛素酶功能之外的调控作用。 OTUB1 存在两种由选择性剪接产生的亚型：一种是普遍表达的较短的 31 kDa 亚型，另一种是表达更为局限的较长的 35 kDa 亚型，主要在淋巴器官中表达。OTUB1 在细胞过程中发挥多种作用，包括通过抑制 E2 酶 UBE2N 的活性来修复 DNA 损伤、调节免疫以及通过抑制 MDM2 催化的泛素化来调节 p53 的稳定性，而这种调节通常与其去泛素化酶活性无关。OTUB1 还通过与 mTORC1 的关键组分 RAPTOR 相互作用并稳定 RAPTOR 来调节营养信号通路，从而影响癌细胞的存活和耐药性。OTUB1 在酪氨酸 26 位的磷酸化是 RAPTOR 相互作用和 mTORC1 激活的关键，这提示在肾癌中存在一条新的 Src-OTUB1-mTORC1 轴。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38264570/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30400005/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%