Ras (G12V Mutant Specific) Antibody [E10J6]

目录号: F0959

抗体应用：反应性：Human

Lane 1: 293T, Lane 2: 293T (human KRAS-G12V transfected)

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
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操作要点

WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。

使用信息

稀释比例
WB1:1000

抗体应用
WB

反应性
Human

抗体类型
Rabbit Monoclonal Antibody

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量
21 kDa

阳性对照	SW620 (G12V) cells
阴性对照	THP-1 (G12D) cells; LS174T (G12D) cells; HCT116 (G13D) cells; NCI-H358 (G12C) cells; NCI-H1703 (WT) cells; NCI-H1 650 (WT) cells

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 60 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 60 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
Ras (G12V Mutant Specific) Antibody [E10J6] 仅检测具有 G12V 点突变的内源性总 Ras 蛋白水平。

蛋白定位
细胞膜，细胞质，内膜系统

Uniprot ID
P01116

克隆号
E10J6

别名
GTPase KRas; K-Ras 2; Ki-Ras; c-K-ras; c-Ki-ras; KRAS; KRAS2; RASK2

背景
Ras（G12V突变体特异性）是经典小GTP酶的一种致癌变体，最常见于KRAS亚型，其第12位的甘氨酸被缬氨酸取代。这种取代在P环/开关II界面处造成空间位阻，阻止了催化位点Gln61和GAP-Arg789指状结构域促进内在和GAP介导的GTP水解，但仍允许鸟嘌呤核苷酸交换因子进行正常的GDP/GTP交换。因此，Ras G12V持续处于活性GTP结合状态，使其开关I/II区域刚性稳定，从而持续与效应分子结合。这种组成型激活驱动下游信号通路持续激活，例如Raf/MEK/ERK通路（促进增殖）、PI3K/AKT/mTOR通路（支持细胞存活和血管生成）、RalGDS/Ral通路（促进侵袭和转移）以及TIAM1/Rac通路（控制细胞骨架重塑）。与其他G12突变体相比，G12V突变体通过促进II型开关/α3螺旋处的二聚化界面并暴露疏水性Val12，从而增强Raf的过度激活，并促进原丝间的相互作用。该突变体的水解抗性支持在细胞膜上形成稳定的纳米簇，从而放大生长因子信号并赋予细胞对靶向治疗（例如EGFR抑制剂）的耐药性。Ras G12V突变在结直肠癌、胰腺癌、甲状腺癌和胆道癌中尤为常见，并且与这些癌症的侵袭性进展和不良预后相关。

背景

Ras（G12V突变体特异性）是经典小GTP酶的一种致癌变体，最常见于KRAS亚型，其第12位的甘氨酸被缬氨酸取代。这种取代在P环/开关II界面处造成空间位阻，阻止了催化位点Gln61和GAP-Arg789指状结构域促进内在和GAP介导的GTP水解，但仍允许鸟嘌呤核苷酸交换因子进行正常的GDP/GTP交换。因此，Ras G12V持续处于活性GTP结合状态，使其开关I/II区域刚性稳定，从而持续与效应分子结合。这种组成型激活驱动下游信号通路持续激活，例如Raf/MEK/ERK通路（促进增殖）、PI3K/AKT/mTOR通路（支持细胞存活和血管生成）、RalGDS/Ral通路（促进侵袭和转移）以及TIAM1/Rac通路（控制细胞骨架重塑）。与其他G12突变体相比，G12V突变体通过促进II型开关/α3螺旋处的二聚化界面并暴露疏水性Val12，从而增强Raf的过度激活，并促进原丝间的相互作用。该突变体的水解抗性支持在细胞膜上形成稳定的纳米簇，从而放大生长因子信号并赋予细胞对靶向治疗（例如EGFR抑制剂）的耐药性。Ras G12V突变在结直肠癌、胰腺癌、甲状腺癌和胆道癌中尤为常见，并且与这些癌症的侵袭性进展和不良预后相关。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41309533/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34776511/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%