RPA70/RPA1 Antibody [N23A19]
目录号: F6430
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: C2C12, Lane 2: Hela, Lane 3: C6, Lane 4: HUVEC
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
|---|
| WB |
| 反应性 |
|---|
| Human, Mouse, Rat |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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70 kDa
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| 阳性对照 | C2C12 cells; HeLa cells; C6 cells; HUVEC cells; MCF7 cells; WI‑38 cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| RPA70/RPA1 Antibody [N23A19] 可检测内源性 RPA70/RPA1 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞核 |
| Uniprot ID |
|---|
| P27694 |
| 克隆号 |
|---|
| N23A19 |
| 别名 |
|---|
| Replication protein A 70 kDa subunit; RPA1 |
| 背景 |
|---|
| RPA70，也称为RPA1，是异源三聚体复制蛋白A复合物中最大的亚基，该复合物对真核生物DNA代谢至关重要。RPA70通过高亲和力单链DNA结合，协调复制、修复和检查点激活。该蛋白包含三个不同的DNA结合域，这些结构域通过柔性连接子连接，并包含蛋白相互作用模块，使其能够与RPA32和RPA14亚基寡聚化，形成一个稳定的平台，用于募集复制和修复因子。在复制叉延伸过程中，RPA70包裹停滞复制叉处产生的单链DNA，通过直接结合DNA聚合酶α-引物酶的p180亚基来定位该酶，同时保护新生链免受核酸酶的降解，并通过协调的三聚化界面促进PCNA的加载。当DNA双链断裂或紫外线诱导损伤时，ATR和DNA-PK在N端结构域内多个丝氨酸/苏氨酸位点的过度磷酸化会诱导结构域间连接蛋白的构象开放，从而增强其与9-1-1检查点钳和Rad17-RFC加载蛋白的亲和力，进而放大ATR-CHK1信号级联反应，最终通过Cdc25A降解来阻滞S期。这种修饰还通过暴露BRCT基序，使RPA70能够与BRCA1和RAD51旁系同源蛋白结合，从而引导单链DNA尾部进入突触前丝状结构组装。RPA70能够稳定切口后形成的微泡，并协调XPA/Rad23B的结合，以在聚合酶募集前验证损伤特异性识别。该复合物维持基础核定位，并在损伤位点形成可诱导的聚集灶，PP2A 的去磷酸化作用可在修复后恢复复制能力。RPA70 在增殖组织中的普遍表达使其成为基因组稳定性检测中不可或缺的成分，其显性负突变体可破坏复制许可并导致对基因毒素的超敏反应。 |
| 参考文献 |
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