S100B Antibody [P12F20]
目录号: F5857
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: SK-MEL-28
操作要点
WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：20%。
湿转参考条件：200 mA, 60 min，建议使用 0.22 μm PVDF膜。
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：20%。
湿转参考条件：200 mA, 60 min，建议使用 0.22 μm PVDF膜。
使用信息
| 稀释比例 |
|---|
|
| 抗体应用 |
|---|
| WB, IHC, IF |
| 反应性 |
|---|
| Human, Mouse, Rat |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
|---|
| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
|---|
| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
|
预测分子量
|
|---|
|
10 kDa
|
| 阳性对照 | Human soft tissue squamous cell carcinoma; Human colon carcinoma; Human prostate adenocarcinoma; Mouse cerebral cortex; Mouse spleen; Mouse hippocampus; Human brain; Rat brain; Mouse brain; SK-MEL-2 cells, SK-MEL-28 cells |
|---|---|
| 阴性对照 | Mouse lung; T-470 cells; A-172 cells |
实验方法
| WB |
|---|
实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：20 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.22 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
|
| IF |
|---|
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
|
| IHC |
|---|
实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
|
生物描述
| 特异性 |
|---|
| S100B Antibody [P12F20] 可检测内源性 S100B 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞质，细胞核，细胞外环境 |
| Uniprot ID |
|---|
| P04271 |
| 克隆号 |
|---|
| P12F20 |
| 别名 |
|---|
| Protein S100-B; S-100 protein beta chain; S-100 protein subunit beta; S100 calcium-binding protein B; S100B |
| 背景 |
|---|
| S100B属于S100家族的EF-手型钙结合蛋白，主要作为细胞内调节因子和细胞外信号分子，在中枢神经系统的星形胶质细胞和少突胶质细胞中含量丰富。每个单体包含两个EF-手型结构域，钙结合后形成反平行同源二聚体，通过构象变化暴露疏水表面，从而与多种靶标相互作用。S100B通过结合F-肌动蛋白和微管相关蛋白来调节细胞骨架动力学，抑制蛋白激酶C（PKC）磷酸化，促进应力纤维解聚和膜皱褶形成，同时影响能量代谢和Ca²⁺稳态，进而调控星形胶质细胞的增殖、分化和迁移。 S100B 通过与 RAGE 受体结合发挥剂量依赖性作用，在低生理浓度下激活 Ras/MEK/ERK/NF-κB/Bcl-2 信号通路，促进神经保护、神经突生长和星形胶质细胞增殖；而在高病理浓度下，则过度激活 ERK 并导致 ROS 过量产生，从而诱导神经元凋亡。这种双相作用还延伸至 RAGE/p38MAPK/pAkt/mTOR/HIF1α 通路，该通路在癌细胞中上调 VEGF 和 NO 的表达，同时抑制 p53 的表达。S100B 维持神经胶质细胞的形态和运动能力，这对血脑屏障的完整性和突触支持至关重要，因此它是研究发育和修复过程中星形胶质细胞-少突胶质细胞相互作用的关键靶点，而钙离子流决定着细胞反应。S100B 在灰质原浆星形胶质细胞和白质少突胶质细胞中的表达表明其在髓鞘形成和神经炎症调节中发挥着组织特异性作用。慢性升高导致的失调通过促炎性 NF-κB 激活促进结直肠癌的肿瘤血管生成和侵袭。 |
| 参考文献 |
|---|
|
技术支持
在订购、运输、储存和使用我们的产品的任何阶段，您遇到的任何问题，均可以通过拨打我们的热线电话400-668-6834，或者技术支持邮箱tech@selleck.cn，直接联系到我们。我们会在24小时内尽快联系您。
* 必填项
