Securin Antibody [E2P20]
目录号: F5314
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: HT-29, Lane 2: HT-29 (Thymidine, 2 mM, 16 h)
操作要点
WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP |
| 反应性 |
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| Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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25 kDa
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| 阳性对照 | HT-29 cells (Thymidine, 2 mM, 16 h; Nocodazole for 10 nM, 24 hr); Jurkat cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| Securin Antibody [E2P20] 可检测内源性 Securin 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞质，细胞核 |
| Uniprot ID |
|---|
| O95997 |
| 克隆号 |
|---|
| E2P20 |
| 别名 |
|---|
| Securin; Pituitary tumor-transforming gene 1 protein; PTTG1 |
| 背景 |
|---|
| Securin由垂体肿瘤转化基因1 (PTTG1)编码，是一种多功能调控蛋白，它控制着有丝分裂检查点的准确性、染色体分离以及非有丝分裂过程，例如细胞迁移和基因表达。Securin作为二聚体抑制剂，结合并抑制蛋白酶分离酶，防止黏连蛋白复合物过早裂解，从而使姐妹染色单体保持连接直至后期开始。此外，Securin的不同结构域还支持不依赖于分离酶的活性，这些活性调节微管成核、DNA修复反应和p53相关的转录。 Securin通过协调分离酶的激活与纺锤体附着完成和检查点满足，确保后期时间的精确控制。其泛素化降解由后期促进复合物/细胞周期蛋白体（APC/C）介导，从而释放分离酶，驱动黏连蛋白的去除和染色体分离。这些过程的缺陷会导致非整倍体和基因组不稳定。在间期细胞和迁移细胞中，胞质Securin定位于中心体和高尔基体，并与微管组织中心蛋白（如GM130、AKAP450和γ-微管蛋白）结合，刺激微管成核和重塑，这对于细胞极化、定向迁移和侵袭至关重要。在癌症模型中，Securin的过表达会增强这些细胞运动行为。 Securin 表达与增殖状态和临床结果相关，小鼠遗传学研究表明 Pttg1/securin 缺失会导致自发性乳腺肿瘤，并破坏导管形态发生。 |
| 参考文献 |
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