SH2D1A Antibody [C12N16]

目录号: F5021

抗体应用：反应性：Human

Lane 1: MOLT4, Lane 2: Jurkat

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
400-668-6834 info@selleck.cn

操作要点

本抗体需使用抗大鼠二抗。

WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：20%。
湿转参考条件：200 mA, 60 min，建议使用 0.22 μm PVDF膜。
建议曝光 120s 以上。

使用信息

稀释比例
WB1:1000 FCM1:400

抗体应用
WB, FCM

反应性
Human

抗体类型
Rat Monoclonal Antibody

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量
14 kDa

阳性对照	Molt4 cells; Jurkat cells
阴性对照

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：20 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.22 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 60 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。 (建议曝光时长 120s 以上)

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：20 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.22 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 60 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。 (建议曝光时长 120s 以上)

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
SH2D1A Antibody [C12N16] 可检测内源性 SH2D1A 总蛋白水平。

蛋白定位
细胞质

Uniprot ID
O60880

克隆号
C12N16

别名
SH2 domain-containing protein 1A; Duncan disease SH2-protein; Signaling lymphocytic activation molecule-associated protein (SLAM-associated protein); T-cell signal transduction molecule SAP; SH2D1A; DSHP; SAP

背景
SH2D1A，又称SAP或SLAM相关蛋白，是一种小型胞内衔接蛋白，属于SH2结构域家族，由X染色体上的SH2D1A基因编码，主要在T细胞、NK细胞、NKT细胞和B细胞中表达。它由一个SH2结构域和两侧的短N端和C端尾部组成，并具有一个独特的非磷酸酪氨酸依赖性结合口袋，其中关键残基包括精氨酸28、丝氨酸35和精氨酸78，这些残基能够识别SLAM家族受体（如SLAM、2B4等）上的三叉结构域。SAP/SH2D1A与SLAM家族受体具有高亲和力结合，且无需磷酸化，这使其区别于依赖磷酸酪氨酸识别的传统SH2结构域。这种独特的相互作用依赖于一个“三叉戟”式的结构基序，该基序与关键的SH2残基相互作用，从而实现强大的衔接蛋白功能。该蛋白具有结构灵活性，配体结合后会形成不同的构象复合物，并且在105位残基之后未检测到长程相互作用。SAP通过SH3结构域相互作用将Fyn等Src家族激酶募集到SLAM受体，并竞争性地阻断SHP-1和SHP-2等抑制性磷酸酶的募集。这导致下游MAPK/ERK信号通路的激活、钙离子内流以及包括干扰素-γ和TNF-α在内的细胞因子的产生，从而促进细胞毒性、细胞毒性T细胞和NK细胞中溶细胞颗粒的极化、NKT细胞的发育、生发中心形成所需的结核分枝杆菌（TB）细胞相互作用以及抑制淋巴细胞增殖的再刺激诱导的细胞死亡。SAP对于抗病毒免疫（尤其是针对EB病毒的免疫）、体液免疫反应以及维持免疫稳态至关重要。 SH2D1A基因突变（目前已报道约有50种）通常会导致蛋白质截短或破坏SH2结合，从而丧失这些功能，并导致X连锁淋巴增生性疾病1型（也称为邓肯氏病）。该疾病的特征是致命的EB病毒感染性单核细胞增多症、淋巴瘤高风险、低丙种球蛋白血症以及由于B细胞增殖失控和细胞毒性免疫反应失败而导致的噬血细胞性淋巴组织细胞增生症。

背景

SH2D1A，又称SAP或SLAM相关蛋白，是一种小型胞内衔接蛋白，属于SH2结构域家族，由X染色体上的SH2D1A基因编码，主要在T细胞、NK细胞、NKT细胞和B细胞中表达。它由一个SH2结构域和两侧的短N端和C端尾部组成，并具有一个独特的非磷酸酪氨酸依赖性结合口袋，其中关键残基包括精氨酸28、丝氨酸35和精氨酸78，这些残基能够识别SLAM家族受体（如SLAM、2B4等）上的三叉结构域。SAP/SH2D1A与SLAM家族受体具有高亲和力结合，且无需磷酸化，这使其区别于依赖磷酸酪氨酸识别的传统SH2结构域。这种独特的相互作用依赖于一个“三叉戟”式的结构基序，该基序与关键的SH2残基相互作用，从而实现强大的衔接蛋白功能。该蛋白具有结构灵活性，配体结合后会形成不同的构象复合物，并且在105位残基之后未检测到长程相互作用。SAP通过SH3结构域相互作用将Fyn等Src家族激酶募集到SLAM受体，并竞争性地阻断SHP-1和SHP-2等抑制性磷酸酶的募集。这导致下游MAPK/ERK信号通路的激活、钙离子内流以及包括干扰素-γ和TNF-α在内的细胞因子的产生，从而促进细胞毒性、细胞毒性T细胞和NK细胞中溶细胞颗粒的极化、NKT细胞的发育、生发中心形成所需的结核分枝杆菌（TB）细胞相互作用以及抑制淋巴细胞增殖的再刺激诱导的细胞死亡。SAP对于抗病毒免疫（尤其是针对EB病毒的免疫）、体液免疫反应以及维持免疫稳态至关重要。 SH2D1A基因突变（目前已报道约有50种）通常会导致蛋白质截短或破坏SH2结合，从而丧失这些功能，并导致X连锁淋巴增生性疾病1型（也称为邓肯氏病）。该疾病的特征是致命的EB病毒感染性单核细胞增多症、淋巴瘤高风险、低丙种球蛋白血症以及由于B细胞增殖失控和细胞毒性免疫反应失败而导致的噬血细胞性淋巴组织细胞增生症。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/11823424/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/20926771/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%