SMRT Antibody [M7D13]
目录号: F6347
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: MOLT-4
操作要点
WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
湿转参考条件：250 mA, 180 min。
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
湿转参考条件：250 mA, 180 min。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, ChIP |
| 反应性 |
|---|
| Human, Monkey |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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270 kDa
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| 阳性对照 | MOLT-4 cells; SW620 cells; HeLa cells; 293T cells; LS-180 cells (Calcitriol, 10 nM, 3 h) |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：250 mA, 180 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| SMRT Antibody [M7D13] 可检测内源性 SMRT 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞核 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q9Y618 |
| 克隆号 |
|---|
| M7D13 |
| 别名 |
|---|
| Silencing mediator of retinoic acid and thyroid hormone receptor; SMRT; NCOR2 |
| 背景 |
|---|
| SMRT属于NCoR/SMRT家族的核受体共抑制因子，该家族通过在未结合配体的核受体上组装多亚基抑制复合物来介导转录沉默。SMRT的N端抑制结构域与SANT基序交错排列，C端CoRNR盒相互作用结构域则形成两亲性螺旋，并与受体配体结合结构域上的疏水沟槽对接。SMRT通过一个去乙酰化酶激活结构域将核受体与HDAC3连接起来。该结构域包含第一个SANT基序，通过变构作用稳定HDAC3的催化口袋，从而解除HDAC3的自身抑制；而第二个SANT基序则形成一个组蛋白相互作用结构域，优先结合未乙酰化的H3/H4尾部，以增强底物呈递并放大靶启动子的去乙酰化作用。抑制结构域募集mSin3A、GPS2和TBL1/TBLR1支架蛋白，通过募集HP1和PRC2复合物，协调组蛋白低乙酰化、DNA甲基化和染色质致密化，从而传递基因沉默信息。与甲状腺激素和视黄酸受体的相互作用，在发育过程中强化谱系特异性基因抑制，而选择性剪接产生的异构体则通过CoRNR盒的不同使用来调节受体特异性。SMRT通过抑制肝脏中的脂肪生成程序和间充质前体细胞中的脂肪生成程序来调控代谢稳态，其动态交换由配体诱导的构象变化决定，这种构象变化会使辅阻遏物脱离，从而促进辅激活物的结合。易位或突变导致的SMRT失调会损害急性早幼粒细胞白血病和甲状腺疾病中的激素反应性。 |
| 参考文献 |
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