SPHK2 Antibody [A21H5]

目录号: F6714

抗体应用：反应性：Human

Lane 1: Raji, Lane 2: MOLT4

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
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使用信息

稀释比例
WB1:1000 IP1:50

抗体应用
WB, IP

反应性
Human

抗体类型
Rabbit Monoclonal Antibody

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量
75 kDa

阳性对照	Human kidney; Raji cells; MOLT-4 cells
阴性对照

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
SPHK2 Antibody [A21H5] 可检测内源性 SPHK2 总蛋白水平。

蛋白定位
细胞质，内质网，溶酶体，内膜系统，线粒体，线粒体内膜，细胞核

Uniprot ID
Q9NRA0

克隆号
A21H5

别名
Sphingosine kinase 2; SPHK2

背景
SPHK2 与 SPHK1 同属鞘氨醇激酶家族，催化鞘氨醇及其相关底物的 ATP 依赖性磷酸化，生成鞘氨醇-1-磷酸 (S1P)。S1P 是一种生物活性脂质介质，通过自分泌和旁分泌作用调控细胞内信号传导和细胞间通讯。SPHK2 具有保守的激酶结构域，两侧是核定位和输出信号，使其能够在应激条件下于细胞质、细胞核和细胞器（例如内质网）之间动态穿梭。其酶活性主要体现在 ATP-Mg 结合磷酸化鞘氨醇碱基上，从而改变鞘脂平衡，使其从促凋亡的神经酰胺和鞘氨醇向促生存的 S1P 转变。此外，其底物特异性还延伸至溶酶体分解代谢途径中的鞘二烯。 SPHK2衍生的S1P与HDAC1/2在抑制复合物内结合，抑制其去乙酰化酶活性，从而打开细胞周期蛋白基因启动子处的染色质，促进细胞周期进程的表观遗传激活，并调控DNA损伤反应。胞质SPHK2整合来自受体酪氨酸激酶和G蛋白偶联受体的信号，在关键丝氨酸和苏氨酸残基上发生ERK1介导的磷酸化，从而在EGF等生长因子刺激下放大S1P的输出，进而激活PI3K/AKT/mTOR和MAPK/ERK信号通路，驱动细胞迁移、增殖和代谢适应。SPHK2还通过与S1P结合稳定端粒酶逆转录酶（hTERT），保护端粒免受MKRN1介导的泛素化修饰，维持干细胞和祖细胞的复制潜能。 SPHK2在巨噬细胞中维持线粒体呼吸、端粒完整性和自噬通量，从而防止胆固醇外流过程中脂滴积累和泡沫细胞形成。在生理条件下，SPHK2维持造血和神经祖细胞的静止状态，同时促进其响应细胞因子梯度而分化，其在脑和肝组织中的表达峰值反映了其在脂质质量控制和缺血预适应中的作用。SPHK2在实体瘤和白血病中表达失调，导致其通过NF-κB/STAT3激活和组蛋白修饰赋予肿瘤细胞化疗耐药性，或者当其转运至应激颗粒时，反而诱导细胞凋亡。

背景

SPHK2 与 SPHK1 同属鞘氨醇激酶家族，催化鞘氨醇及其相关底物的 ATP 依赖性磷酸化，生成鞘氨醇-1-磷酸 (S1P)。S1P 是一种生物活性脂质介质，通过自分泌和旁分泌作用调控细胞内信号传导和细胞间通讯。SPHK2 具有保守的激酶结构域，两侧是核定位和输出信号，使其能够在应激条件下于细胞质、细胞核和细胞器（例如内质网）之间动态穿梭。其酶活性主要体现在 ATP-Mg 结合磷酸化鞘氨醇碱基上，从而改变鞘脂平衡，使其从促凋亡的神经酰胺和鞘氨醇向促生存的 S1P 转变。此外，其底物特异性还延伸至溶酶体分解代谢途径中的鞘二烯。 SPHK2衍生的S1P与HDAC1/2在抑制复合物内结合，抑制其去乙酰化酶活性，从而打开细胞周期蛋白基因启动子处的染色质，促进细胞周期进程的表观遗传激活，并调控DNA损伤反应。胞质SPHK2整合来自受体酪氨酸激酶和G蛋白偶联受体的信号，在关键丝氨酸和苏氨酸残基上发生ERK1介导的磷酸化，从而在EGF等生长因子刺激下放大S1P的输出，进而激活PI3K/AKT/mTOR和MAPK/ERK信号通路，驱动细胞迁移、增殖和代谢适应。SPHK2还通过与S1P结合稳定端粒酶逆转录酶（hTERT），保护端粒免受MKRN1介导的泛素化修饰，维持干细胞和祖细胞的复制潜能。 SPHK2在巨噬细胞中维持线粒体呼吸、端粒完整性和自噬通量，从而防止胆固醇外流过程中脂滴积累和泡沫细胞形成。在生理条件下，SPHK2维持造血和神经祖细胞的静止状态，同时促进其响应细胞因子梯度而分化，其在脑和肝组织中的表达峰值反映了其在脂质质量控制和缺血预适应中的作用。SPHK2在实体瘤和白血病中表达失调，导致其通过NF-κB/STAT3激活和组蛋白修饰赋予肿瘤细胞化疗耐药性，或者当其转运至应激颗粒时，反而诱导细胞凋亡。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32521763/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34055895/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%