Src Antibody [L10F23]
目录号: F4132
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: A431, Lane 2: Hela, Lane 3: Jurkat, Lane 4: RD
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
|---|
| WB, IP |
| 反应性 |
|---|
| Human, Mouse, Rat, Monkey |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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60 kDa
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| 阳性对照 | A431 cells; CH01 elies1 cells; HeLa cells; Jurkat cells; 293 cells; RD cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
|---|
实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| Src Antibody [L10F23] 可检测内源性 Src 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞连接，细胞膜，细胞质，细胞骨架，内膜系统，线粒体，线粒体内膜，细胞核 |
| Uniprot ID |
|---|
| P12931 |
| 克隆号 |
|---|
| L10F23 |
| 别名 |
|---|
| Proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src; Proto-oncogene c-Src; pp60c-src; SRC |
| 背景 |
|---|
| Src属于Src家族的非受体酪氨酸激酶，该家族通过多种信号通路调控细胞生长、黏附和分化。Src由一个SH3结构域和一个SH2结构域组成，SH3结构域通过一个多聚脯氨酸连接子与一个SH2结构域相连，SH2结构域可结合磷酸酪氨酸。此外，Src还包含一个双叶激酶结构域，该结构域具有一个调控性激活环和一个C端酪氨酸尾。激活环内Tyr416的磷酸化可稳定一种开放构象，在该构象中，环上的催化天冬氨酸和精氨酸残基排列整齐，便于底物配位。而去磷酸化或突变则允许即使在由Csk激酶介导的C端Tyr527磷酸化所稳定的封闭构象中，Src也能短暂地处于活性状态。 Tyr416位点的分子间自磷酸化是通过二聚化实现的，二聚化使激酶结构域并置。随后，Src磷酸化黏着斑处的底物，例如FAK，从而激活paxillin和p130Cas，进而促进Rac1介导的伪足延伸，从而在细胞迁移过程中发挥作用。Src还通过直接反式磷酸化作用与EGFR和PDGFR结合，放大MAPK/ERK和PI3K/AKT信号通路。同时，Csk介导的Tyr527磷酸化募集SH2结构域磷酸酶，例如PTP1B，通过尾部钳制SH2结构域来重置自身抑制。Src通过αvβ3整合素信号通路协调破骨细胞的骨吸收，并通过NMDA受体调节调控神经元突触可塑性。Src的普遍表达通过肉豆蔻酰化和棕榈酰化修饰来调控其膜定位。 |
| 参考文献 |
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