SSH1 Antibody [K8K10]

目录号: F1247

抗体应用：反应性：Human, Mouse, Rat

Lane 1: Jurkat, Lane 2: Raji, Lane 3: SH-SY5Y, Lane 4: Hela

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
400-668-6834 info@selleck.cn

操作要点

WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。

使用信息

稀释比例
WB1:1000 IP1:100

抗体应用
WB, IP

反应性
Human, Mouse, Rat

抗体类型
Rabbit Monoclonal Antibody

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量
140 kDa

阳性对照	Jurkat cells; Raji cells; SH-SY5Y cells; U-87 MG cells; SK-MEL-28 cells; HeLa cells
阴性对照

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
SSH1 Antibody [K8K10] 可检测内源性 SSH1 总蛋白水平。

蛋白定位
细胞突起，细胞质，细胞骨架

Uniprot ID
Q8WYL5

克隆号
K8K10

别名
Protein phosphatase Slingshot homolog 1; SSH-like protein 1 (SSH-1L; hSSH-1L); SSH1; KIAA1298; SSH1L

背景
Slingshot 同源物 1 (SSH1) 是一种双特异性蛋白磷酸酶，它通过在 Ser3 位点去磷酸化 cofilin，从而重新激活其 F-肌动蛋白切割和解聚功能，对肌动蛋白细胞骨架动力学起着核心作用，而这些功能对于片状伪足突出、丝状伪足形成、细胞迁移、胞质分裂和神经元形态发生至关重要。 SSH1 具有 N 端调节结构域，其中含有肌动蛋白结合基序，在与 F-肌动蛋白结合后，可变构地刺激磷酸酶活性 14 倍；中央催化磷酸酶结构域（Cys-X5-Arg/Ser 基序，其中 Asp487 用于磷酸配位，Arg502 用于稳定），两侧是用于 LIMK1 底物接近的非结构化环；以及 C 端 F-肌动蛋白结合结构域（包括 Trp1001、Lys1023），该结构域促进 SSH1 的稳定和肌动蛋白的聚集，而与磷酸酶活性无关。在静息细胞中，SSH1 位于胞质中，并通过 14-3-3 与磷酸化 Ser978 结合而自我抑制，但当 Rho GTPase 信号传导（ROCK/PAK 通过 LIMK/TESK 介导的 cofilin 磷酸化）或整合素/FAK 激活时，SSH1 去磷酸化并转移到膜上，在那里 F-肌动蛋白停靠暴露其活性位点。这使得cofilin能够快速重新激活（kcat/Km ~10^6 M^-1 s^-1），产生用于Arp2/3成核的自由带刺末端，回收G-肌动蛋白进行踏车运动，并在Rho/ROCK-LIMK-cofilin-SSH1反馈回路中平衡LIMK介导的失活，该回路调节上皮间质转化、癌症侵袭（其中上调的SSH1通过WNT/β-catenin串扰与HCC和乳腺肿瘤的转移相关）、神经退行性变（通过SQSTM1通量缺陷导致Tau清除受损）和血管通透性。

背景

Slingshot 同源物 1 (SSH1) 是一种双特异性蛋白磷酸酶，它通过在 Ser3 位点去磷酸化 cofilin，从而重新激活其 F-肌动蛋白切割和解聚功能，对肌动蛋白细胞骨架动力学起着核心作用，而这些功能对于片状伪足突出、丝状伪足形成、细胞迁移、胞质分裂和神经元形态发生至关重要。 SSH1 具有 N 端调节结构域，其中含有肌动蛋白结合基序，在与 F-肌动蛋白结合后，可变构地刺激磷酸酶活性 14 倍；中央催化磷酸酶结构域（Cys-X5-Arg/Ser 基序，其中 Asp487 用于磷酸配位，Arg502 用于稳定），两侧是用于 LIMK1 底物接近的非结构化环；以及 C 端 F-肌动蛋白结合结构域（包括 Trp1001、Lys1023），该结构域促进 SSH1 的稳定和肌动蛋白的聚集，而与磷酸酶活性无关。在静息细胞中，SSH1 位于胞质中，并通过 14-3-3 与磷酸化 Ser978 结合而自我抑制，但当 Rho GTPase 信号传导（ROCK/PAK 通过 LIMK/TESK 介导的 cofilin 磷酸化）或整合素/FAK 激活时，SSH1 去磷酸化并转移到膜上，在那里 F-肌动蛋白停靠暴露其活性位点。这使得cofilin能够快速重新激活（kcat/Km ~10^6 M^-1 s^-1），产生用于Arp2/3成核的自由带刺末端，回收G-肌动蛋白进行踏车运动，并在Rho/ROCK-LIMK-cofilin-SSH1反馈回路中平衡LIMK介导的失活，该回路调节上皮间质转化、癌症侵袭（其中上调的SSH1通过WNT/β-catenin串扰与HCC和乳腺肿瘤的转移相关）、神经退行性变（通过SQSTM1通量缺陷导致Tau清除受损）和血管通透性。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36637427/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25187968/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%