Syntenin-1/MDA9 Antibody [B6B6]
目录号: F6829
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: A172, Lane 2: MCF7
操作要点
WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP, IF, FCM |
| 反应性 |
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| Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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30 kDa
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| 阳性对照 | MUTZ‑3 cells; SK‑MEL‑5 cells; A‑172 cells; MCF7 cells |
|---|---|
| 阴性对照 | Daudi cells |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
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实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| Syntenin-1/MDA9 Antibody [B6B6] 可检测内源性 Syntenin-1/MDA9 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞连接，细胞膜，细胞质，细胞骨架，内质网，内膜系统，细胞核，细胞外环境 |
| Uniprot ID |
|---|
| O00560 |
| 克隆号 |
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| B6B6 |
| 别名 |
|---|
| Syntenin-1; Melanoma differentiation-associated protein 9; MDA-9; SDCBP |
| 背景 |
|---|
| Syntenin-1，也称为MDA-9或SDCBP，属于PDZ结构域支架衔接蛋白家族，该家族在组装多分子复合物方面发挥着关键作用，这些复合物在多种细胞环境中协调膜运输和信号转导。其结构核心是两个串联的PDZ结构域，两侧是无结构的N端和C端区域，这使得它能够与跨膜伴侣（如聚糖蛋白）的C端基序高亲和力结合，并通过保守的LYPX(n)L序列与ALIX直接相互作用，从而募集内体分选机制。在聚糖蛋白-合成蛋白-ALIX通路中，肝素酶切割聚糖蛋白的硫酸肝素链，触发合成蛋白-1多聚化和ALIX募集，进而驱动晚期内体腔内区室出芽形成多泡体，最终成熟为富含聚糖蛋白片段、CD63以及生物活性物质（如FGFR1或miR-494-3p）的外泌体。该级联反应以浓度依赖的方式放大外泌体的生物合成，其中前肝素酶的内吞加工使其转化为活性酶，从而增强合成蛋白-ALIX的结合以及随后的囊泡释放。 Syntenin-1 通过将整合素与促侵袭性肌动蛋白动力学连接起来，进一步调节 FAK-Src 信号通路；在其 GDP 结合状态下，通过与 Rheb 结合激活 mTOR，从而调节细胞增殖；并通过与 syndecan-2 竞争，取代 CASK，从而与 Wnt/β-catenin 信号通路相互作用，稳定树突棘，并通过 ephrinB3 促进兴奋性轴突突触的形成。在神经元发育过程中，Rheb 的核苷酸状态决定了 syntenin 的水平，活性 Rheb 解离会增加游离 syntenin 的水平，使其与 syndecan-2 的尾部结合，从而抑制 TSC 模型中的树突棘成熟。在肺癌、乳腺癌和黑色素瘤中，syntenin-1 的过表达通过增强外泌体介导的 miRNA 转移来重编程基质细胞，从而驱动转移和血管生成；而致癌 Ras 则维持这一通路，以装载促肿瘤物质。 |
| 参考文献 |
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