TBC1D1 Antibody [C20L8]

目录号: F9884

抗体应用：反应性：Mouse

Lane 1: C2C12

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
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操作要点

WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。

使用信息

稀释比例
WB1:1000 IP1:50

抗体应用
WB, IP

反应性
Mouse

抗体类型
Rabbit Monoclonal Antibody

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量
160 kDa

阳性对照	Mouse tibialis anterior muscle; mIMCD3 cells; C2C12 myoblasts
阴性对照

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
TBC1D1 Antibody [C20L8] 可检测内源性 TBC1D1 总蛋白水平。

蛋白定位
细胞核

Uniprot ID
Q60949

克隆号
C20L8

别名
TBC1 domain family member 1; TBC1D1; KIAA1108

背景
TBC1D1 是一种 Rab-GTP 酶激活蛋白 (Rab-GAP)，在骨骼肌中富集，与 AS160/TBC1D4 密切相关。它作为一种关键的代谢传感器，通过调节 GLUT4 囊泡运输，协调胰岛素和肌肉收缩引起的葡萄糖摄取。胰岛素激活 Akt，导致 TBC1D1 在 Thr590 位点磷酸化，从而解除 Rab10 和 Rab14 的抑制，促进 GLUT4 胞吐。相反，肌肉收缩或 AICAR 激活 AMPK，磷酸化 Ser231、Ser660 和 Ser700 位点，促进 14-3-3 蛋白的结合，进一步解除 Rab-GAP 的抑制，增强 GLUT4 的转位，且该过程独立于 Akt。肌肉收缩会增加 AMPK 位点的磷酸化，而胰岛素则通过 Akt2 选择性地靶向 Thr590 位点。 AMPKα2 失活显著降低了这些位点的收缩刺激磷酸化水平，凸显了 AMPK 在运动过程中的主导作用。这种双重调控最终导致 Rab10 失活。磷酸化缺失的 TBC1D1 突变体加速了收缩刺激的 GLUT4 转位，而 TBC1D1 过表达则损害了胰岛素敏感性。TBC1D1 对于骨骼肌在禁食、运动和进食期间的代谢灵活性至关重要，是利用转基因模型或磷酸化位点特异性抗体进行研究的主要靶点，尤其是在运动模拟药物的研究中。TBC1D1 的功能缺失突变会导致严重的肥胖和胰岛素抵抗，其磷酸化模式在高脂饮食诱导的胰岛素抵抗中仍然保持完整，这强调了其在运动信号传导中的作用。

背景

TBC1D1 是一种 Rab-GTP 酶激活蛋白 (Rab-GAP)，在骨骼肌中富集，与 AS160/TBC1D4 密切相关。它作为一种关键的代谢传感器，通过调节 GLUT4 囊泡运输，协调胰岛素和肌肉收缩引起的葡萄糖摄取。胰岛素激活 Akt，导致 TBC1D1 在 Thr590 位点磷酸化，从而解除 Rab10 和 Rab14 的抑制，促进 GLUT4 胞吐。相反，肌肉收缩或 AICAR 激活 AMPK，磷酸化 Ser231、Ser660 和 Ser700 位点，促进 14-3-3 蛋白的结合，进一步解除 Rab-GAP 的抑制，增强 GLUT4 的转位，且该过程独立于 Akt。肌肉收缩会增加 AMPK 位点的磷酸化，而胰岛素则通过 Akt2 选择性地靶向 Thr590 位点。 AMPKα2 失活显著降低了这些位点的收缩刺激磷酸化水平，凸显了 AMPK 在运动过程中的主导作用。这种双重调控最终导致 Rab10 失活。磷酸化缺失的 TBC1D1 突变体加速了收缩刺激的 GLUT4 转位，而 TBC1D1 过表达则损害了胰岛素敏感性。TBC1D1 对于骨骼肌在禁食、运动和进食期间的代谢灵活性至关重要，是利用转基因模型或磷酸化位点特异性抗体进行研究的主要靶点，尤其是在运动模拟药物的研究中。TBC1D1 的功能缺失突变会导致严重的肥胖和胰岛素抵抗，其磷酸化模式在高脂饮食诱导的胰岛素抵抗中仍然保持完整，这强调了其在运动信号传导中的作用。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/20701589/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18276596/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%