TBK1/NAK Antibody [C14L9]
目录号: F4145
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Raji
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
|---|
| WB, IP, IF, FCM |
| 反应性 |
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| Human, Mouse, Rat |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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84 kDa
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| 阳性对照 | HCT 116 cells; HCC827 cells; Raji cells; BaF3 cells; RBL-1 cells; U20S cells |
|---|---|
| 阴性对照 | TALL-1 cells |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Tris-HCL Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Tris-HCL Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Tris-HCL Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
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实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| TBK1/NAK Antibody [C14L9] 可检测内源性 TBK1/NAK 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
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| 细胞质 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q9UHD2 |
| 克隆号 |
|---|
| C14L9 |
| 别名 |
|---|
| Serine/threonine-protein kinase TBK1; NF-kappa-B-activating kinase; T2K; TANK-binding kinase 1; TBK1; NAK |
| 背景 |
|---|
| TBK1（TANK结合激酶1，NAK）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，与IKKε同属IKK家族，它整合多种固有免疫信号，作为中心枢纽，将胞质DNA/RNA感知与髓系细胞、成纤维细胞和上皮屏障的炎症转录汇聚在一起。TBK1具有N端激酶结构域、中央支架/二聚化区域以及C端泛素结合的TBK1/IKKi卷曲螺旋结构域，该结构域在与STING、MAVS或TRIF等衔接蛋白结合后，可激活Ser172位点的反式自磷酸化。配体诱导的聚集，例如环状二核苷酸与STING的结合，通过特定的pLxIS基序募集TBK1二聚体，触发K48/K63连接的多聚泛素化，从而解除自身抑制，并使IRF3/7在多个丝氨酸位点发生顺序磷酸化，进而促进其二聚化、核转位和I型干扰素的诱导；同时，通过NEMO/RelA激活IKK复合物，维持NF-κB驱动的细胞因子产生，而TBK1磷酸化STAT6以促进趋化因子表达，并磷酸化OPTN以选择性自噬胞质病原体。这种双重作用协调了即时的抗病毒状态和适应性募集，因为TBK1磷酸化p62以清除聚集体，并磷酸化mTORC1组分以平衡感染期间的代谢重编程。 TBK1在树突状细胞中协调抗病毒防御，通过TANK/Optineurin螯合的负反馈机制限制免疫病理，并维持肺上皮屏障的完整性，因此是研究人员通过磷酸化IRF3蛋白印迹或cGAMP刺激的CRISPR类器官检测胞质感知保真度的首选指标。功能缺失突变会导致遗传性螺旋体病和免疫缺陷，而体细胞扩增则通过YAP/TEAD非经典信号通路驱动KRAS突变型肺癌的存活。 |
| 参考文献 |
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