TH1L Antibody [N21A8]
目录号: F7974
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: HCT116, Lane 2: RAW264.7, Lane 3: COS-7
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP, ChIP |
| 反应性 |
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| Human, Mouse, Rat, Monkey |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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66 kDa
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| 阳性对照 | HCT 116 cells; Raw 264.7 cells; KNRK cells; COS-7 cells; MCF7 cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
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| TH1L Antibody [N21A8] 可检测内源性 TH1L 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞核 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q8IXH7 |
| 克隆号 |
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| N21A8 |
| 别名 |
|---|
| Negative elongation factor C/D; NELF-C/D; TH1-like protein; NELFCD; NELFD; TH1; TH1L |
| 背景 |
|---|
| TH1L（也称为NELF-C/D）是后生动物特有的负延伸因子（NELF）复合物亚基，该复合物还包括WHSC2（NELF-A）、COBRA-1（NELF-B）和NELF-E，并在参与转录调控的哺乳动物组织中广泛表达。TH1L与COBRA-1共同构成NELF复合物的核心结构，将WHSC2和NELF-E物理连接起来，从而组装成功能性的四聚体NELF复合物，该复合物能够与RNA聚合酶II（RNAPII）结合。NELF复合物与DRB敏感诱导因子（DSIF）复合物在许多基因的启动子近端区域协同作用，抑制RNAPII的延伸，并建立一种暂停状态。在这种状态下，RNA聚合酶停滞在转录起始位点附近，需要额外的信号才能进行有效的延伸。 RNAPII从暂停状态释放是由正性转录延伸因子b (p-TEFb)介导的，p-TEFb磷酸化NELF（包括NELF-E）和最大RNAPII亚基的羧基末端结构域(CTD)，从而减弱NELF与RNAPII的结合，使延伸得以继续进行。在NELF复合物中，TH1L有助于亚基的正确组装和复合物的稳定性，TH1L位点的替代翻译起始会产生不同的异构体，这些异构体可能影响复合物的化学计量或定位。含有TH1L的NELF-C和NELF-D异构体均可支持NELF的组装和功能，这表明TH1L与广泛的转录程序调控有关，该程序控制着早期基因、发育调控因子和应激反应基因位点。 |
| 参考文献 |
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