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THRB Antibody [K5L2]

目录号: F3941

    抗体应用： 反应性：
    • Lane 1: Mouse pancreas
    规格 价格 库存 购买数量
    20uL 790 现货
    50uL 1240 现货
    100uL 1990 现货
    100uL*2 3790 现货

    400-668-6834

    info@selleck.cn

    操作要点

    WB
    建议曝光 120s 以上。

    使用信息

    稀释比例
    1:1000
    1:50
    1:20
    1:500
    抗体应用
    WB, IP, IHC, IF
    反应性
    Human, Mouse, Rat
    抗体类型
    Mouse Monoclonal Antibody
    储存液配方
    PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
    储存条件(自收到货起)
    -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
    预测分子量
    52 kDa; 55 kDa
    阳性对照 Human Colon tissue; Human Thyroid tissue
    阴性对照

    实验方法

    WB
    实验步骤：
     
    样品制备
    1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。
    2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
    3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
    4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
    5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
    6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
     
    电泳分离
    1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
    2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
     
    转膜
    1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
    2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
    3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
    4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
    湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
    （注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
     
    封闭
    1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
    2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
    3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
     
    抗体孵育
    1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
    2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
    3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
    4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
     
    显色
    1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
    2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。 (建议曝光时长 120s 以上)
     
    IF
    实验步骤：
     
    标本制备
    1. 吸出液体，然后用 1X PBS 稀释的 4% 多聚甲醛覆盖细胞至 2-3 mm 的深度。
    注意：多聚甲醛有毒，只能在通风橱中使用。
    2. 室温固定细胞 15 分钟。
    3. 吸出固定液，用 1X PBS 冲洗 3 次，每次 5 分钟。
    4. 继续进行免疫染色。
     
    免疫染色
    1. 添加封闭缓冲液并在室温下孵育 60 分钟。
    2. 按照建议在抗体稀释缓冲液中制备一抗稀释液。
    3. 吸出封闭液，加入制备好的一抗稀释液。
    4. 4°C 孵育过夜。
    5. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。
    6. 将样本放入用抗体稀释缓冲液稀释的荧光染料偶联二抗中，室温避光孵育 1-2 小时。
    7. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。
    8. 使用带有 DAPI 的封固剂封固载玻片并盖上盖玻片。
    9. 为获得最佳效果，请让封固剂在室温下固化过夜。 如需长期保存，请将载玻片平放在 23°C 避光保存。
     
    IF
    实验步骤：
    样品准备
    1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
    2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
    3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
    4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
     
    固定
    1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
    2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
     
    通透
    1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
    （仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
    2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
     
    封闭
    添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
    注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
     
    免疫荧光染色（第一天）
    1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
    2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
     
    免疫荧光染色（第二天）
    1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
    2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
    3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
    4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
    5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
     
    封片
    1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
    2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
    3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
     
    IHC
    实验步骤：
     
    脱蜡/补液
    1. 脱蜡/水合切片：
    2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
    3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
    4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
    5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
    6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
     
    染色
    1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
    2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
    3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
    4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
    5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
    6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
    7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
    8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
    9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
    10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
    11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
    12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
    13. 如果需要，用苏木精复染切片。
    14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
    15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
    16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
     

    Datasheet & SDS

    生物描述

    特异性

    THRB Antibody [K5L2] 可检测内源性 THRB 总蛋白水平。
    蛋白定位
    细胞核
    Uniprot ID
    P10828
    克隆号
    K5L2
    别名
    c-erbA-2; c-erbA-beta; ERBA 2; ERBA BETA; ERBA-BETA; MGC126109; MGC126110; Nuclear receptor subfamily 1 group A member 2; oncogene ERBA2; thyroid hormone nuclear receptor beta variant 1; Thyroid hormone receptor beta; thyroid hormone receptor beta 3; thyroid hormone receptor beta2delta; thyroid hormone receptor, beta (avian erythroblastic leukemia
    背景

    甲状腺激素受体β (THRB) 是一种配体依赖性核转录因子，属于核受体超家族，主要由甲状腺激素三碘甲状腺原氨酸 (T3) 激活。THRB 与 THRA 同属甲状腺激素受体家族，通过选择性剪接和启动子使用产生多种亚型，从而发挥其多种功能。THRB 包含四个关键结构域：调节转录活性的 N 端激活功能-1 (AF-1) 结构域；包含用于识别甲状腺激素反应元件 (TRE) 的锌指结构域的高度保守的 DNA 结合结构域 (DBD)；提供灵活性的铰链区；以及结合 T3 并介导与辅激活因子和辅抑制因子相互作用的配体结合结构域 (LBD)。在没有配体的情况下，THRB 与辅抑制复合物（例如 N-CoR 和 SMRT）结合，从而抑制靶基因转录。 T3结合后，LBD的构象变化取代了辅抑制因子，并募集了SRC-1等共激活因子，从而激活了参与代谢、发育和分化的基因。THRB亚型表现出组织特异性的表达模式，其中THRB1分布广泛，而THRB2主要表达于脑、耳蜗、视网膜和下丘脑，并调节神经发育和感觉功能。THRB对代谢率、心血管健康、听觉和视觉系统发育起着关键作用，并通过调节促甲状腺激素(TSH)合成，对下丘脑-垂体-甲状腺轴产生负反馈，从而维持激素稳态。THRB基因突变会导致甲状腺激素抵抗，其特征是循环甲状腺激素水平升高，受体功能受损，从而导致生长迟缓、听力损失和代谢功能障碍。
    参考文献
    • https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/20610536/
    • https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/14651789/

    技术支持

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