TIMP2 Antibody [L18F24]

目录号: F4624

抗体应用：反应性：Human, Mouse, Monkey

Lane 1: HT-1080, Lane 2: A172, Lane 3: COS-7

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
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操作要点

WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。

使用信息

稀释比例
WB1:1000

抗体应用
WB

反应性
Human, Mouse, Monkey

抗体类型
Rabbit Monoclonal Antibody

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量
22 kDa

阳性对照	HT-1080 cell; A172 cell; COS-7 cell
阴性对照

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 60 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 60 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
TIMP2 Antibody [L18F24] 可检测内源性 TIMP2 总蛋白水平。

蛋白定位
细胞外环境

Uniprot ID
P16035

克隆号
L18F24

别名
Metalloproteinase inhibitor 2; CSC-21K; Tissue inhibitor of metalloproteinases 2 (TIMP-2); TIMP2

背景
TIMP2（金属蛋白酶组织抑制剂2）是TIMP家族（TIMP1-4）中最丰富的成员，TIMP家族是一类保守的分泌型糖蛋白，可调节细胞外基质（ECM）的重塑。TIMP2由两个二硫键稳定的结构域组成：一个N端抑制结构域（127个氨基酸，具有寡糖/寡核苷酸结合折叠、五链β桶结构、三个二硫键和一个用于MMP特异性的延伸AB环）和一个C端网蛋白样结构域（67个氨基酸，含有三个额外的二硫键，促进血红素结合结构域的结合）。N端半胱氨酸残基1通过Met-Tyr对螯合MMP中的催化锌，总共六个二硫键维持着该蛋白的楔形构象。 TIMP2通过占据基质金属蛋白酶（尤其是MMP-2和MMP-9）的活性位点，不可逆地抑制它们的活性。此外，TIMP2还能独特地促进前体MMP2的活化，它通过与细胞表面的MT1-MMP同源二聚体结合形成TIMP2-proMMP2-MT1-MMP三元复合物，该复合物经切割后生成活性MMP2。TIMP2还通过BC环中的RGD样基序与α3β1整合素相互作用，激活SHP-1磷酸酶，从而抑制内皮细胞的增殖、迁移和血管生成，并通过与VEGFR2和其他整合素的相互作用调节细胞外基质（ECM）信号传导。TIMP2对于组织稳态、伤口愈合和血管重塑至关重要，而其失调会导致癌症转移（通过MMP失衡）、纤维化（通过ECM过度沉积）和肿瘤血管生成。

背景

TIMP2（金属蛋白酶组织抑制剂2）是TIMP家族（TIMP1-4）中最丰富的成员，TIMP家族是一类保守的分泌型糖蛋白，可调节细胞外基质（ECM）的重塑。TIMP2由两个二硫键稳定的结构域组成：一个N端抑制结构域（127个氨基酸，具有寡糖/寡核苷酸结合折叠、五链β桶结构、三个二硫键和一个用于MMP特异性的延伸AB环）和一个C端网蛋白样结构域（67个氨基酸，含有三个额外的二硫键，促进血红素结合结构域的结合）。N端半胱氨酸残基1通过Met-Tyr对螯合MMP中的催化锌，总共六个二硫键维持着该蛋白的楔形构象。 TIMP2通过占据基质金属蛋白酶（尤其是MMP-2和MMP-9）的活性位点，不可逆地抑制它们的活性。此外，TIMP2还能独特地促进前体MMP2的活化，它通过与细胞表面的MT1-MMP同源二聚体结合形成TIMP2-proMMP2-MT1-MMP三元复合物，该复合物经切割后生成活性MMP2。TIMP2还通过BC环中的RGD样基序与α3β1整合素相互作用，激活SHP-1磷酸酶，从而抑制内皮细胞的增殖、迁移和血管生成，并通过与VEGFR2和其他整合素的相互作用调节细胞外基质（ECM）信号传导。TIMP2对于组织稳态、伤口愈合和血管重塑至关重要，而其失调会导致癌症转移（通过MMP失衡）、纤维化（通过ECM过度沉积）和肿瘤血管生成。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36624735/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37572947/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%