VCP Antibody [P13E12]

目录号: F5022

抗体应用：反应性：Human, Mouse, Rat, Monkey

Lane 1: Hela, Lane 2: NIH/3T3, Lane 3: C6, Lane 4: COS

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
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使用信息

稀释比例
WB1:1000

抗体应用
WB

反应性
Human, Mouse, Rat, Monkey

抗体类型
Rabbit Monoclonal Antibody

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量
89 kDa

阳性对照	U20S cells; HeLa cells; NIH/3T3 cells; C6 cells; COS cells
阴性对照

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
VCP Antibody [P13E12] 可检测内源性 VCP 总蛋白水平。

蛋白定位
细胞质，内质网，细胞核，溶酶体

Uniprot ID
P55072

克隆号
P13E12

别名
Transitional endoplasmic reticulum ATPase; TER ATPase; 15S Mg(2+)-ATPase p97 subunit; Valosin-containing protein (VCP); VCP; HEL-220; HEL-S-70

背景
VCP (p97) 是一种在各种组织中大量表达的 II 型 AAA+ ATPase，它组装成同源六聚体双环圆柱体，从膜、染色质、核糖体和蛋白质复合物中提取泛素化的底物蛋白，用于蛋白酶体降解、自噬或重折叠。每个亚基包含一个 N 端结构域（泛素结合的 UBX 样折叠，通过 S2/S3/S4 亚结构域协调辅助因子）、D1/D2 ATPase 结构域（具有 Walker A/B 基序的 RecA 样折叠，其中 D2 提供主要的水解作用并产生约 100 nm 的转位力）、L1/L2 结构域间连接区（用于变构调节）以及一个 C 端尾部（赋予辅助因子特异性）；六聚体的中心孔由 48 个芳香族/疏水性残基构成，可穿过未折叠的多肽。它表现出分离酶活性：ATP 与 D1 环结合组装六聚体，而 D2 水解产生动力冲程，依次通过 N 结构域-辅因子复合物 (UFD1-NPL4/VCIP135/p37) 抓住底物，将底物拉过中央孔（展开速率约为 1-2 nm/秒），进行内质网相关降解（泛素化错误折叠蛋白的 ERAD）、核糖体质量控制（去除停滞的新生链）、内体-溶酶体损伤修复 (ELDR/溶酶体自噬) 和有丝分裂纺锤体解体（Aurora A 染色质驱逐）；磷酸化（ATM 对 Ser784 的磷酸化，CDK 对 Thr688 的磷酸化）调节 VCP 定位。 VCP 维持蛋白质稳态（清除应激颗粒）、细胞器动力学（线粒体融合/分裂）、DNA 修复（同源重组修复/非同源末端连接）和细胞周期保真度（G2/M 期检查点）；其在神经组织中的富集解释了多系统蛋白病。疾病相关性：杂合突变（R93C/R155C）通过毒性功能获得（组成型六聚化、ATPase 活性增强约 2 倍）导致 IBMPFD2、ALS14 和多系统蛋白病。

背景

VCP (p97) 是一种在各种组织中大量表达的 II 型 AAA+ ATPase，它组装成同源六聚体双环圆柱体，从膜、染色质、核糖体和蛋白质复合物中提取泛素化的底物蛋白，用于蛋白酶体降解、自噬或重折叠。每个亚基包含一个 N 端结构域（泛素结合的 UBX 样折叠，通过 S2/S3/S4 亚结构域协调辅助因子）、D1/D2 ATPase 结构域（具有 Walker A/B 基序的 RecA 样折叠，其中 D2 提供主要的水解作用并产生约 100 nm 的转位力）、L1/L2 结构域间连接区（用于变构调节）以及一个 C 端尾部（赋予辅助因子特异性）；六聚体的中心孔由 48 个芳香族/疏水性残基构成，可穿过未折叠的多肽。它表现出分离酶活性：ATP 与 D1 环结合组装六聚体，而 D2 水解产生动力冲程，依次通过 N 结构域-辅因子复合物 (UFD1-NPL4/VCIP135/p37) 抓住底物，将底物拉过中央孔（展开速率约为 1-2 nm/秒），进行内质网相关降解（泛素化错误折叠蛋白的 ERAD）、核糖体质量控制（去除停滞的新生链）、内体-溶酶体损伤修复 (ELDR/溶酶体自噬) 和有丝分裂纺锤体解体（Aurora A 染色质驱逐）；磷酸化（ATM 对 Ser784 的磷酸化，CDK 对 Thr688 的磷酸化）调节 VCP 定位。 VCP 维持蛋白质稳态（清除应激颗粒）、细胞器动力学（线粒体融合/分裂）、DNA 修复（同源重组修复/非同源末端连接）和细胞周期保真度（G2/M 期检查点）；其在神经组织中的富集解释了多系统蛋白病。疾病相关性：杂合突变（R93C/R155C）通过毒性功能获得（组成型六聚化、ATPase 活性增强约 2 倍）导致 IBMPFD2、ALS14 和多系统蛋白病。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26945625/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37611827/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%