WDR59 Antibody [P9B16]
目录号: F8457
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: MCF7, Lane 2: Hela, Lane 3: Jurkat, Lane 4: ACHN
操作要点
WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
|---|
| WB, IP |
| 反应性 |
|---|
| Human, Monkey |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
|---|
| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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110 kDa
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| 阳性对照 | MCF7 cells; HeLa cells; Jurkat cells; ACHN cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| WDR59 Antibody [P9B16] 可检测内源性 WDR59 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 溶酶体，内膜系统 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q6PJI9 |
| 克隆号 |
|---|
| P9B16 |
| 别名 |
|---|
| WD repeat-containing protein 59; WDR59 |
| 背景 |
|---|
| WDR59属于WD重复结构域蛋白家族，是GATOR2复合物的核心支架亚基。GATOR2复合物是一种多蛋白复合物，定位于溶酶体表面，能够感知氨基酸，从而激活mTORC1通路，进而调控细胞生长和合成代谢过程。WDR59与WDR24和MIOS等亚基一起整合到GATOR2的大型笼状结构中。其WD重复结构域促进复合物的稳定形成，并保护MIOS和WDR24等组分免受蛋白水解酶的降解，确保在营养充足的条件下复合物的完整性。在mTORC1信号通路的氨基酸感知环节，WDR59增强了GATOR2的功能，使其直接拮抗GATOR1复合物，抑制其对RagA/B GTP酶的GAP活性，从而使Rag异二聚体能够结合GTP，进而将mTORC1募集到溶酶体，并被Rheb及其上游信号激活。该机制将细胞外氨基酸（尤其是亮氨酸和精氨酸）的可用性与细胞内mTORC1的输出（包括蛋白质合成、自噬抑制和代谢重编程）联系起来，其中WDR59维持GATOR2的完整性，从而在长期营养刺激下维持这些反应。实验性敲除WDR59会导致GATOR2不稳定、GATOR1活性升高并损害mTORC1信号传导，凸显了其在通路保真度中不可替代的作用。WDR59支持组织特异性适应，果蝇中组织特异性效应即证明了这一点：在果蝇中，WDR59的缺失会以不同程度地增强或抑制卵巢和眼原基盘等结构的生长，反映了mTORC1的调控具有情境依赖性。双等位基因突变导致的失调表现为早发性常染色体隐性扩张型心肌病，其中 GATOR2 功能减弱可能破坏心脏 mTORC1 依赖的稳态、肥大和能量代谢。 |
| 参考文献 |
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