XAF1 Antibody [C23J4]
目录号: F8798
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Hela, Lane 2: Hela (IFN-α, 10 ng/ml, 16 h)
操作要点
WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP |
| 反应性 |
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| Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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32 kDa, 38 kDa
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| 阳性对照 | HT-29 cells (hIFN-α1, 10 ng/ml, overnight); HeLa cells (hIFN-α1, 10 ng/ml, overnight); MCF7 cells (hIFN-α1, 10 ng/ml, overnight); Jurkat cells (hIFN-α1, 10 ng/ml, overnight) |
|---|---|
| 阴性对照 | HT-29 cells; HeLa cells; MCF7 cells |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
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| XAF1 Antibody [C23J4] 可检测内源性 XAF1 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
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| 细胞质，线粒体，细胞核 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q6GPH4 |
| 克隆号 |
|---|
| C23J4 |
| 别名 |
|---|
| XIAP-associated factor 1; XAF1 |
| 背景 |
|---|
| X染色体连锁凋亡相关因子1抑制因子（XAF1）是一种含锌指结构的蛋白质，它通过拮抗XIAP的抗caspase活性并调节多种应激信号通路，发挥促凋亡肿瘤抑制因子的作用。XAF1含有多个C2-H2锌指结构域，可介导蛋白质-蛋白质相互作用，包括直接结合XIAP、p53以及HIPK2-ZNF313轴的组成部分，使其能够影响这些调节因子的稳定性和活性，而不仅仅是作为中性衔接蛋白发挥作用。 XAF1 通过 STAT 和 IRF-1 依赖性回路进行转录诱导，并作为干扰素信号的反馈放大器发挥作用，增强应激诱导的细胞凋亡和细胞对外源性死亡信号的敏感性；而在 p53 功能正常的细胞中，XAF1 通过与 E3 泛素连接酶 MDM2 竞争结合 p53，与 p53 形成正反馈回路，从而稳定 p53 并促进 HIPK2 介导的 p53 Ser46 磷酸化和 ZNF313 依赖的 p21 泛素化，这些共同作用使 p53 的结果偏向于细胞凋亡而不是细胞周期停滞。 XAF1参与非caspase依赖性通路，包括通过调节Akt-p70S6K通路诱导自噬和上调Beclin-1。近期证据表明，XAF1可通过内溶酶体途径从应激肿瘤细胞中主动分泌，从而增强T细胞介导的肿瘤监视，将内在的内质网应激和DNA损伤信号与适应性免疫控制联系起来。XAF1的表达常因启动子高甲基化或p53相关抑制而受到抑制，低水平的XAF1与多种上皮恶性肿瘤的晚期、低分化和不良预后相关，而其恢复则可抑制肿瘤生长并增强细胞对细胞毒性药物的敏感性。 |
| 参考文献 |
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