Mouse CD4+ Cell lsolation Kit

缓冲液配制： PBS缓冲液（pH 7.2）包括0.5%的BSA和2 mM EDTA，需预先通过0.22 μm滤膜过滤除菌。

1. 样本准备：
淋巴/非淋巴组织样本(以小鼠脾脏为例):
a. 在70 μm细胞筛网上研磨脾脏，以预冷的 PBS 冲洗细胞筛网，收集细胞悬液于50 ml 离心管中，500 g，离心5 min。
b. 离心完成后，弃上清，加入5 ml ACK 红细胞裂解液，室温裂解5 min，再加入20 ml PBS，500 g，离心5 min。
注意：红细胞裂解步骤可根据所用裂解液不同调整用量及时间。少量红细胞残留不会影响后续分选及细胞纯度。
c. 离心完成后，弃上清，将脾细胞重悬于PBS，细胞悬液用70 μm细胞筛网过滤后，计数。计数完成后，继续以500 g，离心5 min。
d. 离心完成后，弃上清，将细胞重悬于分选 buffer 中，调整细胞密度为1×10⁸ cells/ml。
小鼠外周血样本：
a. 新鲜抗凝全血加入 PBS 或生理盐水按 1:1 比例稀释降低血液粘稠度，使用淋巴细胞分离液 Ficoll，通过密度梯度离心法分离得到 PBMC。
b. 向 PBMC 中加入 5-10 倍体积的分选 buffer，混匀后离心,300 g 离心10 min，弃上清。重复洗涤 2-3 次。
c. 用分选 buffer 重悬细胞，调整细胞密度为1×10⁸ cells/ml。
2. 大鼠血清孵育：每10⁷ 细胞中加入 20 µL 正常大鼠血清，混匀后常温孵育10 min，每隔5 min 轻弹混匀。
注意：分选更多细胞时，按比例增加大鼠血清用量（如分选5×10⁷细胞，需在500 µL 细胞悬液中加入100µL 大鼠血清）。
3. CD4微珠标记：每10⁷细胞中加入 10 µL CD4微珠，混匀后 4 ℃孵育15 min，每隔5 min轻弹混匀，避免细胞聚集。
注意：分选更多细胞时，按比例增加CD4微珠用量（如分选5×10⁷细胞，需在500 μL细胞悬液中加入50 μL CD4微珠）。
4. 洗涤细胞：孵育完成后，加入1 mL分选buffer（避免剧烈振荡或上下颠倒混匀）。300 g离心3 min，弃上清，加入1 mL分选buffer重悬细胞。
5. 磁珠分选：
将分选柱置于MACS分离器的磁场中，用缓冲液冲洗分选柱（MS柱： 500 μL；LS柱： 3 mL）。
将细胞悬液加入分选柱，收集未标记的流经细胞（可选），再用分选液清洗分选柱（MS柱： 2×1 mL；LS柱： 2×3 mL）。
6. 收集CD4阳性细胞：移出分选柱，加入适量缓冲液，用柱塞快速冲洗，收集磁性标记的CD4阳性细胞（MS柱： 2×1 mL；LS柱： 2×3 mL）。
注意：每次液体完全流尽后再进行下一步操作。
7.（可选）二次富集： 若需更高纯度，可重复步骤5-6，在第二个分选柱上再次富集CD4阳性细胞。
实验全程保持低温（4℃），动作迅速以减少细胞损伤。