ALDH1A3 Antibody [J5E20]
目录号: F7704
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: HT-29, Lane 2: U-87 MG, Lane 3: PC-3, Lane 4: Mouse kidney
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP, IHC |
| 反应性 |
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| Human, Mouse, Rat |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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53 kDa
50 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Human kidney tissue; Mouse kidney tissue; Mouse kidney tissue; Rat lung tissue; Rat kidney tissue; HT-29 cells; U-87 MG cells; PC-3 cells; C6 cells |
|---|---|
| 阴性对照 | MCF7 cells |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Tris-HCL Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Tris-HCL Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Tris-HCL Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
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| ALDH1A3 Antibody [J5E20] 可检测内源性 ALDH1A3 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
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| 细胞质 |
| Uniprot ID |
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| P47895 |
| 克隆号 |
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| J5E20 |
| 别名 |
|---|
| ALDH6, ALDH1A3, Retinaldehyde dehydrogenase 3, RALDH-3, RalDH3, Aldehyde dehydrogenase 6, Aldehyde dehydrogenase family 1 member A3 |
| 背景 |
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| ALDH1A3 是 ALDH1 家族中的一种胞质醛脱氢酶，催化视黄醛氧化为视黄酸，使其成为组织中局部类视黄醇信号传导的关键调节因子，这些组织中分化、存活和应激反应受到严格调控。该酶具有保守的 ALDH 折叠结构，活性位点包含一个催化半胱氨酸残基，并具有在醛底物氧化过程中协调 NAD⁺ 的辅因子结合元件；其组装成高级寡聚体状态有助于高效处理视黄醛池，从而为视黄酸响应性转录程序提供底物。ALDH1A3 衍生的视黄酸与视黄酸受体和类视黄醇 X 受体结合，调节基因表达，这种活性塑造了神经元和胶质细胞群的转录图谱，在这些细胞群中，分化、自我更新能力和抗应激能力都与类视黄醇代谢密切相关。在间充质胶质瘤干细胞中，ALDH1A3 的表达定义了一个具有高醛脱氢酶活性和侵袭性行为的亚群，其酶促产生的视黄酸维持着生存因子组织转谷氨酰胺酶的表达，从而支持细胞的自我更新、增殖以及对标准基因毒性治疗的耐药性。在胶质母细胞瘤和其他胶质瘤中，ALDH1A3 与间充质转录特征相关，并与多种通路相连，包括控制上皮-间质可塑性、细胞外基质重塑以及细胞对氧化和代谢应激反应的通路。该酶参与与铁死亡、自噬和代谢重编程交叉的网络，其对醛解毒和类视黄醇信号的调控影响着细胞在治疗诱导应激下对脂质过氧化和细胞死亡通路的敏感性。在胶质母细胞瘤标本中，ALDH1A3 的表达呈现空间分离和核相关模式，反映了肿瘤微环境中的异质性调控，并与富含干细胞样细胞和耐药克隆的区域相吻合。在包括高级别胶质瘤在内的多种癌症类型中，ALDH1A3 的升高标志着具有增强的干细胞样特征、侵袭潜能和不良预后的肿瘤亚群，这表明该酶的催化和信号传导作用与疾病进展以及值得靶向实验调控的通路层面脆弱性密切相关。 |
| 参考文献 |
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