AMPKγ1 Antibody [M8F13]

目录号: F2347

抗体应用：反应性：Human

Lane 1: 293T, Lane 2: Jurkat

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
400-668-6834 info@selleck.cn

操作要点

WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。

使用信息

稀释比例
WB1:1000 – 1:10000 IP1:100 FCM1:100

抗体应用
WB, IP, FCM

反应性
Human

抗体类型
Rabbit Monoclonal Antibody

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量实际分子量
38 kDa 38 kDa
^*为什么预测分子量和实际分子量会有不同？以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。

阳性对照	HEK293 cells, Jurkat cells, HeLa cells
阴性对照

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 60 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 60 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
AMPKγ1 Antibody [M8F13] 可检测内源性 AMPKγ1 总蛋白水平。

Uniprot ID
P54619

克隆号
M8F13

别名
5'-AMP-activated protein kinase subunit gamma-1; AMPK gamma1; AMPK subunit gamma-1; AMPKg; PRKAG1

背景
AMPKγ1，又称PRKAG1，是AMP激活蛋白激酶（AMPK）的调节性γ亚基。AMPK是一种异源三聚体能量传感器复合物，由α催化亚基和β支架亚基组成。该蛋白包含三个典型的胱硫醚β-合成酶（CBS）结构域，它们两两配对形成四个腺嘌呤核苷酸结合位点。第一个CBS结构域包含一个结合位点，该位点含有关键的精氨酸和组氨酸残基，这些残基对于AMP和ATP的配位至关重要。N端延伸和第二个CBS结构域连接该结构，而C端尾部则有助于稳定异源三聚体的组装。当AMP与其主要结合位点结合时，AMPKγ1发生构象变化，暴露α亚基上的激活环（T环），从而允许上游激酶（如LKB1和CaMKKβ）对其进行磷酸化。这种修饰显著增强了AMPK的激酶活性，并保护其免受蛋白磷酸酶的去磷酸化作用。ADP结合于其他位点可提供适度的激活作用，而ATP结合则通过空间位阻抑制该酶的活性。活化的AMPK磷酸化关键代谢靶点，包括ACC和HMGCR，以抑制脂质和胆固醇的合成，并磷酸化TSC2以限制合成代谢过程。同时，它通过激活PGC1α和ULK1促进线粒体生物合成和自噬，通过GLUT4转位增加葡萄糖摄取，并通过FOXO信号通路抑制糖异生，从而促进分解代谢途径。AMPK还通过磷酸化肌球蛋白轻链激酶和cofilin重塑肌动蛋白结构，从而影响细胞极性。值得注意的是其亚型特异性：γ1亚基在肝细胞和肝脏中占主导地位，在介导二甲双胍的作用中起着至关重要的作用，特别是通过其CBS结构域。 γ1 的缺失会消除激活环的磷酸化，并破坏其抑制血糖的作用。在动物模型中，γ1 的缺失会削弱二甲双胍在高脂饮食下的降血糖作用。破坏 AMP 结合的突变，例如关键精氨酸残基的替换，可以模拟其他 AMPK γ 亚型所致的心脏病理，包括 Wolff-Parkinson-White 综合征。在癌症中，肿瘤细胞可能利用组成型 AMPK 活性在代谢压力下生存，而沉默 γ1 则会抑制此类情况下的增殖。糖尿病中肝脏 γ1 功能缺陷会导致葡萄糖输出增加和代谢调节受损。

背景

AMPKγ1，又称PRKAG1，是AMP激活蛋白激酶（AMPK）的调节性γ亚基。AMPK是一种异源三聚体能量传感器复合物，由α催化亚基和β支架亚基组成。该蛋白包含三个典型的胱硫醚β-合成酶（CBS）结构域，它们两两配对形成四个腺嘌呤核苷酸结合位点。第一个CBS结构域包含一个结合位点，该位点含有关键的精氨酸和组氨酸残基，这些残基对于AMP和ATP的配位至关重要。N端延伸和第二个CBS结构域连接该结构，而C端尾部则有助于稳定异源三聚体的组装。当AMP与其主要结合位点结合时，AMPKγ1发生构象变化，暴露α亚基上的激活环（T环），从而允许上游激酶（如LKB1和CaMKKβ）对其进行磷酸化。这种修饰显著增强了AMPK的激酶活性，并保护其免受蛋白磷酸酶的去磷酸化作用。ADP结合于其他位点可提供适度的激活作用，而ATP结合则通过空间位阻抑制该酶的活性。活化的AMPK磷酸化关键代谢靶点，包括ACC和HMGCR，以抑制脂质和胆固醇的合成，并磷酸化TSC2以限制合成代谢过程。同时，它通过激活PGC1α和ULK1促进线粒体生物合成和自噬，通过GLUT4转位增加葡萄糖摄取，并通过FOXO信号通路抑制糖异生，从而促进分解代谢途径。AMPK还通过磷酸化肌球蛋白轻链激酶和cofilin重塑肌动蛋白结构，从而影响细胞极性。值得注意的是其亚型特异性：γ1亚基在肝细胞和肝脏中占主导地位，在介导二甲双胍的作用中起着至关重要的作用，特别是通过其CBS结构域。 γ1 的缺失会消除激活环的磷酸化，并破坏其抑制血糖的作用。在动物模型中，γ1 的缺失会削弱二甲双胍在高脂饮食下的降血糖作用。破坏 AMP 结合的突变，例如关键精氨酸残基的替换，可以模拟其他 AMPK γ 亚型所致的心脏病理，包括 Wolff-Parkinson-White 综合征。在癌症中，肿瘤细胞可能利用组成型 AMPK 活性在代谢压力下生存，而沉默 γ1 则会抑制此类情况下的增殖。糖尿病中肝脏 γ1 功能缺陷会导致葡萄糖输出增加和代谢调节受损。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30423971/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/17452784/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%