ApoA1 Antibody [L13J2]

目录号: F5020

抗体应用：反应性：Human

Lane 1: Human small intestine, Lane 2: Human plasma

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
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操作要点

WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。

使用信息

稀释比例
WB1:1000

抗体应用
WB

反应性
Human

抗体类型
Mouse Monoclonal Antibody

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量
25 kDa

阳性对照	HepG2 concentrated media
阴性对照	HepG2 cells

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 60 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 60 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
ApoA1 Antibody [L13J2] 可检测内源性 ApoA1 总蛋白水平。

蛋白定位
淀粉样蛋白，高密度脂蛋白，细胞外环境

Uniprot ID
P02647

克隆号
L13J2

别名
Apolipoprotein A-I; Apo-AI; ApoA-I; Apolipoprotein A1; APOA1

背景
载脂蛋白AI（ApoA-I）是高密度脂蛋白（HDL）的主要结构和功能蛋白，主要在肝脏和肠道合成，通过促进ABCA1依赖的胆固醇从外周组织流出至肝脏进行排泄，介导胆固醇逆向转运，从而预防动脉粥样硬化和心血管疾病。成熟的ApoA-I多肽由243个氨基酸组成，包含10个串联的两亲性α螺旋重复序列，其中脯氨酸残基赋予其脂质结合的灵活性；其N端区域稳定无脂形式，中央结构域（140-170）激活卵磷脂胆固醇酰基转移酶（LCAT）进行胆固醇酯化和HDL成熟，C端结构域（181-243）则使其能够高亲和力地结合磷脂，促进新生HDL的形成。载脂蛋白A-I (ApoA-I) 作为卵磷脂胆固醇酰基转移酶 (LCAT) 的辅助因子，与ABCA1和SR-BI受体相互作用促进脂质外流，并通过中和脂多糖和抑制血管黏附分子表达发挥强大的抗炎和抗氧化作用。低ApoA-I水平是冠状动脉疾病的独立危险预测因子，而APOA1基因突变会导致家族性高密度脂蛋白缺乏症或遗传性淀粉样变性，进而导致蛋白质沉积，加速动脉粥样硬化或引起器官功能障碍，此外，ApoA-I还通过损害脂质稳态和慢性炎症与阿尔茨海默病和糖尿病相关。

背景

载脂蛋白AI（ApoA-I）是高密度脂蛋白（HDL）的主要结构和功能蛋白，主要在肝脏和肠道合成，通过促进ABCA1依赖的胆固醇从外周组织流出至肝脏进行排泄，介导胆固醇逆向转运，从而预防动脉粥样硬化和心血管疾病。成熟的ApoA-I多肽由243个氨基酸组成，包含10个串联的两亲性α螺旋重复序列，其中脯氨酸残基赋予其脂质结合的灵活性；其N端区域稳定无脂形式，中央结构域（140-170）激活卵磷脂胆固醇酰基转移酶（LCAT）进行胆固醇酯化和HDL成熟，C端结构域（181-243）则使其能够高亲和力地结合磷脂，促进新生HDL的形成。载脂蛋白A-I (ApoA-I) 作为卵磷脂胆固醇酰基转移酶 (LCAT) 的辅助因子，与ABCA1和SR-BI受体相互作用促进脂质外流，并通过中和脂多糖和抑制血管黏附分子表达发挥强大的抗炎和抗氧化作用。低ApoA-I水平是冠状动脉疾病的独立危险预测因子，而APOA1基因突变会导致家族性高密度脂蛋白缺乏症或遗传性淀粉样变性，进而导致蛋白质沉积，加速动脉粥样硬化或引起器官功能障碍，此外，ApoA-I还通过损害脂质稳态和慢性炎症与阿尔茨海默病和糖尿病相关。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/10828078/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27382195/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%