Arp3 Antibody (Mouse mAb) [N13C13]
目录号: F8928
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: C2C12
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IF |
| 反应性 |
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| Mouse, Rat, Dog, African green monkey, Human |
| 抗体类型 |
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| Mouse Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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47 kDa
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| 阳性对照 | C2C12 cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
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实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| Arp3 Antibody [N13C13] 可检测内源性 Arp3 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞突起，细胞质，细胞骨架，细胞核 |
| Uniprot ID |
|---|
| P61158 |
| 克隆号 |
|---|
| N13C13 |
| 别名 |
|---|
| ARP3, ACTR3, Actin-related protein 3, Actin-like protein 3 |
| 背景 |
|---|
| Arp3由ACTR3基因编码，是一种高度保守的肌动蛋白相关蛋白，它是Arp2/3复合物的核心亚基。Arp2/3复合物是一个由七个成员组成的肌动蛋白成核机制，负责生成动态细胞骨架重塑所需的肌动蛋白丝分支网络。在复合物中，Arp3与Arp2和辅助的ARPC亚基在结构上协同作用，形成一个模板，该模板从已存在的肌动蛋白丝侧面启动子丝组装，从而产生特征性的分支网络，这些网络支持膜突起、细胞内运输和皮质肌动蛋白组织。Arp2/3复合物的激活需要成核促进因子，例如WASP、N-WASP、WAVE、WASH和WHAMM。这些因子的C端WCA结构域能够结合肌动蛋白单体和Arp2/3复合物，诱导构象重排，使Arp2和Arp3重新定位为具有肌动蛋白样二聚体构象，从而能够进行肌动蛋白丝成核。 Arp3依赖的肌动蛋白分支位于Rho家族GTP酶（包括Cdc42和Rac1）的下游，将细胞外刺激与伪足形成、趋化性、内吞作用、囊泡运输和吞噬作用过程中的快速细胞骨架重组联系起来。N-WASP与Cdc42的相互作用刺激质膜上局部的Arp2/3激活，而WAVE复合物则将Rac信号与广泛的伪足肌动蛋白组装偶联，从而驱动定向迁移。含Arp3的复合物还参与涉及内体、高尔基体相关运输和网格蛋白介导的内吞作用的膜运输途径，其通过协调募集皮质肌动蛋白和其他肌动蛋白调节蛋白来稳定分支丝状连接。无活性的Arp2/3维持Arp2和Arp3分离的状态，而激活则会诱导主要的构象转变，使这些亚基排列成丝状核，从而支持带刺端延伸和分支稳定。Arp3调控的肌动蛋白动力学对于免疫细胞活化、神经元形态、上皮组织以及病原体驱动的肌动蛋白重塑至关重要，Arp2/3信号传导的紊乱与白细胞迁移缺陷、囊泡运输受损和细胞极性异常有关。Arp3活性失调还与侵袭性肿瘤行为和转移进展相关，其机制是通过持续激活分支肌动蛋白组装通路，增强细胞运动性和基质侵袭能力；而WASP家族蛋白调控的改变则会导致免疫疾病，例如以肌动蛋白依赖性免疫反应缺陷为特征的Wiskott-Aldrich综合征。 |
| 参考文献 |
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