Atg5 Antibody [A3G17]

目录号: F0422

抗体应用：反应性：Human, Mouse, Rat

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
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使用信息

稀释比例
WB1:1000 IP1:100

抗体应用
WB, IP

反应性
Human, Mouse, Rat

抗体类型
Rabbit Monoclonal Antibody

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量
50-55 kDa

阳性对照	PANC-1 cells; U-87 MG cells; Saos-2 cells; HCT 116 cells; MCF7 cells; OVCAR8 cells; HeLa cells; C2C12 cells; L-929 cells; C6 cells; H-4-II-E cells; MEFs cells
阴性对照

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
Atg5 Antibody [A3G17] 可检测内源性 Atg5 总蛋白水平。

蛋白定位
细胞质，内膜系统

Uniprot ID
Q9H1Y0

克隆号
A3G17

别名
Autophagy protein 5; APG5-like; Apoptosis-specific protein; ATG5; APG5L; ASP

背景
ATG5属于核心自噬相关基因（ATG）家族，该家族对于巨自噬过程中自噬体的形成至关重要。巨自噬是一种保守的分解代谢过程，通过溶酶体降解细胞质内容物。该蛋白具有一个N端结构域，其中包含两个β折叠，用于与ATG12结合；一个中央α螺旋结构域，可与ATG16L1形成卷曲螺旋；以及一个C端甘氨酸残基，该残基对于ATG7（E1样）和ATG10（E2样）介导的泛素样连接至关重要。ATG12-ATG5复合物与ATG16L1非共价结合，形成E3样连接酶复合物，该复合物定位于吞噬泡的凸缘。 ATG5通过促进LC3/ATG8与磷脂酰乙醇胺的脂化作用驱动吞噬泡的延伸，从而在营养匮乏或应激条件下实现膜的扩张、弯曲和自噬体的闭合。该复合物从内质网出口位点和富含磷脂酰肌醇3-磷酸的ω体募集膜，促进杯状吞噬泡生长过程中高曲率结构域的稳定。ATG5易位至线粒体，通过增加线粒体外膜的通透性来触发非凋亡性、不依赖于caspase的细胞死亡；或在DNA损伤后易位至细胞核，与survivin结合，与Aurora B竞争，从而破坏染色体乘客复合物的组装，诱导G2/M期阻滞，并导致有丝分裂灾难。在先天免疫通路中，ATG5通过其AIR结构域与TECPR1结合，促进自噬体-溶酶体融合，抑制过度炎症反应。 ATG5 缺陷会阻断自噬体的形成，导致受损细胞器积累、抗原呈递受损，并在模型中引发神经退行性变。ATG5 的缺失与克罗恩病相关，其机制是通过缺陷的异噬作用和细菌清除；而 ATG5 的过表达则可通过增强自噬通量或诱导细胞凋亡，使癌细胞对治疗更加敏感。ATG5 还可通过清除线粒体来维持细胞在缺氧或化疗条件下的存活，但其核功能可通过稳定 p53 来抑制细胞增殖。ATG5 多态性等遗传变异与 2 型糖尿病相关，其机制是通过降低自噬对胰岛素分泌的调控，以及通过蛋白质聚集体积累导致的神经退行性变。

背景

ATG5属于核心自噬相关基因（ATG）家族，该家族对于巨自噬过程中自噬体的形成至关重要。巨自噬是一种保守的分解代谢过程，通过溶酶体降解细胞质内容物。该蛋白具有一个N端结构域，其中包含两个β折叠，用于与ATG12结合；一个中央α螺旋结构域，可与ATG16L1形成卷曲螺旋；以及一个C端甘氨酸残基，该残基对于ATG7（E1样）和ATG10（E2样）介导的泛素样连接至关重要。ATG12-ATG5复合物与ATG16L1非共价结合，形成E3样连接酶复合物，该复合物定位于吞噬泡的凸缘。 ATG5通过促进LC3/ATG8与磷脂酰乙醇胺的脂化作用驱动吞噬泡的延伸，从而在营养匮乏或应激条件下实现膜的扩张、弯曲和自噬体的闭合。该复合物从内质网出口位点和富含磷脂酰肌醇3-磷酸的ω体募集膜，促进杯状吞噬泡生长过程中高曲率结构域的稳定。ATG5易位至线粒体，通过增加线粒体外膜的通透性来触发非凋亡性、不依赖于caspase的细胞死亡；或在DNA损伤后易位至细胞核，与survivin结合，与Aurora B竞争，从而破坏染色体乘客复合物的组装，诱导G2/M期阻滞，并导致有丝分裂灾难。在先天免疫通路中，ATG5通过其AIR结构域与TECPR1结合，促进自噬体-溶酶体融合，抑制过度炎症反应。 ATG5 缺陷会阻断自噬体的形成，导致受损细胞器积累、抗原呈递受损，并在模型中引发神经退行性变。ATG5 的缺失与克罗恩病相关，其机制是通过缺陷的异噬作用和细菌清除；而 ATG5 的过表达则可通过增强自噬通量或诱导细胞凋亡，使癌细胞对治疗更加敏感。ATG5 还可通过清除线粒体来维持细胞在缺氧或化疗条件下的存活，但其核功能可通过稳定 p53 来抑制细胞增殖。ATG5 多态性等遗传变异与 2 型糖尿病相关，其机制是通过降低自噬对胰岛素分泌的调控，以及通过蛋白质聚集体积累导致的神经退行性变。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25484072/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24947672/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%