ATP citrate lyase Antibody [N17N8]

目录号: F4744

抗体应用：反应性：Human, Mouse, Rat

Lane 1: MCF7, Lane 2: Hela, Lane 3: HepG2

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
400-668-6834 info@selleck.cn

操作要点

WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。

使用信息

稀释比例
WB1:1000

抗体应用
WB

反应性
Human, Mouse, Rat

抗体类型
Rabbit Monoclonal Antibody

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量
125 kDa

阳性对照	MCF7 cells; HeLa cells; Hep G2 cells; mIMCD-3 cells
阴性对照

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
ATP citrate lyase Antibody [N17N8] 可检测内源性 ATP citrate lyase 总蛋白水平。

蛋白定位
细胞质

Uniprot ID
P53396

克隆号
N17N8

别名
ACLY; ATP-citrate synthase; EC:2.3.3.8; ATP-citrate (pro-S-)-lyase (ACL); Citrate cleavage enzyme

背景
ATP柠檬酸裂解酶（ACLY）是一种胞质同源四聚体酶，位于葡萄糖和脂质代谢的交界处。它将线粒体输出的柠檬酸裂解为乙酰辅酶A和草酰乙酸，为从头脂肪生成、胆固醇合成和组蛋白乙酰化提供能量。ACLY的每个亚基由两个主要结构域组成：N端柠檬酸合酶同源（CSH）结构域（包含~1-700位氨基酸残基）结合柠檬酸和辅酶A，通过His760环的摆动和泛酸臂的易位形成柠檬酰辅酶A；C端ATP结合柠檬酸裂解酶样（CL）结构域（~700-1105位氨基酸残基）包含核苷酸结合位点，Mg²⁺-ATP磷酸化在此发生，Asp938和Lys828稳定γ-磷酸转移，以有序的Bi-Bi机制进行。在构象转变过程中，亚基间存在 D2 对称性，用于能量耦合，从 apo（开放的 CCS）到具有柠檬酰-1-磷酸和 CoA 的 CCS 催化中心的紧凑中间态（G281-283、S308、E599、G664-665）。 ACLY 在营养丰富的条件下通过 SREBP-1/2 激活，为脂肪酸合成酶和 HMGCR 提供乙酰辅酶 A，从而驱动合成代谢途径；在 Akt 介导的 Ser455 磷酸化过程中，ACLY 可解除柠檬酸变构，并将 Vmax 提高 3 倍，同时优先利用 ATP 而非 CTP；在缺氧/葡萄糖限制期间，ACLY 与 ACSS2 偶联，进行乙酸补救，以维持细胞增殖；在癌细胞中，ACLY 通过在 MYC/IGF2 启动子处进行 H3K27ac 的核转位，与表观遗传学相互作用，其亚基构象障碍（His760 环、催化中心形成时的回转半径下降）与生化步骤（柠檬酸磷酸化、柠檬酰辅酶 A 的形成和裂解）同步，从而实现约 10⁶ 倍的速率加速。 ACLY 失调过度表达通过 PI3K/AKT/mTORC1 过度激活促进肿瘤（乳腺癌、前列腺癌、胶质母细胞瘤）的代谢重编程，通过 ChREBP 诱导促进高果糖饮食下的肝脂肪变性，而用贝培多酸或 ND-630 抑制 ACLY 可抑制脂肪生成，从而降低 LDL-C 和肿瘤生长，且不损害酮生成。

背景

ATP柠檬酸裂解酶（ACLY）是一种胞质同源四聚体酶，位于葡萄糖和脂质代谢的交界处。它将线粒体输出的柠檬酸裂解为乙酰辅酶A和草酰乙酸，为从头脂肪生成、胆固醇合成和组蛋白乙酰化提供能量。ACLY的每个亚基由两个主要结构域组成：N端柠檬酸合酶同源（CSH）结构域（包含~1-700位氨基酸残基）结合柠檬酸和辅酶A，通过His760环的摆动和泛酸臂的易位形成柠檬酰辅酶A；C端ATP结合柠檬酸裂解酶样（CL）结构域（~700-1105位氨基酸残基）包含核苷酸结合位点，Mg²⁺-ATP磷酸化在此发生，Asp938和Lys828稳定γ-磷酸转移，以有序的Bi-Bi机制进行。在构象转变过程中，亚基间存在 D2 对称性，用于能量耦合，从 apo（开放的 CCS）到具有柠檬酰-1-磷酸和 CoA 的 CCS 催化中心的紧凑中间态（G281-283、S308、E599、G664-665）。 ACLY 在营养丰富的条件下通过 SREBP-1/2 激活，为脂肪酸合成酶和 HMGCR 提供乙酰辅酶 A，从而驱动合成代谢途径；在 Akt 介导的 Ser455 磷酸化过程中，ACLY 可解除柠檬酸变构，并将 Vmax 提高 3 倍，同时优先利用 ATP 而非 CTP；在缺氧/葡萄糖限制期间，ACLY 与 ACSS2 偶联，进行乙酸补救，以维持细胞增殖；在癌细胞中，ACLY 通过在 MYC/IGF2 启动子处进行 H3K27ac 的核转位，与表观遗传学相互作用，其亚基构象障碍（His760 环、催化中心形成时的回转半径下降）与生化步骤（柠檬酸磷酸化、柠檬酰辅酶 A 的形成和裂解）同步，从而实现约 10⁶ 倍的速率加速。 ACLY 失调过度表达通过 PI3K/AKT/mTORC1 过度激活促进肿瘤（乳腺癌、前列腺癌、胶质母细胞瘤）的代谢重编程，通过 ChREBP 诱导促进高果糖饮食下的肝脂肪变性，而用贝培多酸或 ND-630 抑制 ACLY 可抑制脂肪生成，从而降低 LDL-C 和肿瘤生长，且不损害酮生成。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31873304/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/20558738/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%