B7H4 Antibody (Rabbit mAb) [B6K4]
目录号: F7431
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: SK-BR-3, Lane 2: OVCAR-3
操作要点
WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP, IHC, IF, FCM |
| 反应性 |
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| Mouse, Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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31 kDa
45 kDa,65 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Human breast carcinoma tissue; Mouse breast tissue; Human ovarian carcinoma tissue; Human breast tissue; Mouse breast carcinoma tissue; SK-BR-3 cells; MDA-MB-468 cells; NIH:OVCAR-3 cells |
|---|---|
| 阴性对照 | HT-29 cells; HeLa cells |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 在 20 μL 样品中加入蛋白上样缓冲液，可直接冰上备用；或通过温度梯度（如37 ℃煮样、50 ℃煮样、70 ℃煮样、90 ℃煮样、100 ℃煮样）来确定最佳变性条件，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
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实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| B7H4 Antibody (Rabbit mAb) [B6K4] 可检测内源性 B7H4 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞膜，内膜系统 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q7Z7D3 |
| 克隆号 |
|---|
| B6K4 |
| 别名 |
|---|
| B7H4, UNQ659/PRO1291, VTCN1, V-set domain-containing T-cell activation inhibitor 1, B7 homolog 4, B7h.5, Immune costimulatory protein B7-H4, Protein B7S1, T-cell costimulatory molecule B7x, B7-H4 |
| 背景 |
|---|
| B7-H4，又称VTCN1或B7x，是B7家族的I型跨膜糖蛋白，作为一种抑制性免疫检查点配体，在抗原呈递细胞、基质成分和肿瘤细胞之间的界面调控T细胞介导的免疫应答。其胞外区包含B7分子典型的免疫球蛋白样结构域，而短的胞内尾部缺乏经典的信号转导基序，表明其主要功能是作为活化T细胞上尚未鉴定的受体的配体，而非双向信号分子。T细胞上的该配体结合可诱导细胞周期阻滞，抑制细胞增殖，并减少白细胞介素-2的产生，从而减弱效应功能，并限制炎症或肿瘤微环境中抗原特异性T细胞的扩增。单核细胞和肿瘤相关巨噬细胞上B7-H4的诱导表达受微环境信号（包括细胞因子）驱动，并与肿瘤浸润淋巴细胞密度和活性降低相关，表明髓系B7-H4参与局部免疫抑制和抗肿瘤免疫受损。在胃癌患者中，循环单核细胞和肿瘤相关巨噬细胞上B7-H4表达升高与免疫逃逸增强相关，且表达水平越高，疾病进展越严重，这支持了其在抑制T细胞攻击肿瘤细胞方面的功能作用。在肾细胞癌等实体瘤中，B7-H4存在于细胞膜、细胞质和细胞核内，其膜定位与肿瘤浸润淋巴细胞密度呈负相关，而核和膜表达均与肿瘤分期较高相关，表明该分子的空间分布与肿瘤进展和免疫排斥有关。该蛋白包含一个功能性核定位序列，使其能够在细胞质和细胞核之间穿梭；该序列的突变会增加其表面表达，并增强其对T细胞增殖和细胞因子产生的抑制作用。而能够进入细胞核的野生型B7-H4则能促进肿瘤细胞增殖，促进G1/S期转换，并上调细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白E的表达，表明其具有双重作用：既是检查点配体，又是肿瘤内细胞周期调控因子。野生型B7-H4的过表达还能赋予肾癌细胞系化疗耐药性，将其核功能和检查点活性与治疗反应相关的生存通路联系起来。棕榈酰化等翻译后修饰通过阻止乳腺癌细胞中的溶酶体降解并维持免疫抑制来影响B7-H4的稳定性，这使得该分子与更广泛的信号通路相连，从而维持其检查点功能的长期稳定。 B7-H4 在与耐受性和肿瘤免疫逃逸相关的免疫检查点通路中发挥作用，其抑制效应 T 细胞的能力与 PD-L1 类似，并且在髓系细胞和肿瘤细胞上可诱导表达，亚细胞运输和核细胞周期效应共同使其成为免疫治疗策略（如单克隆抗体或抗体药物偶联物）的机制丰富的靶点，这些策略旨在缓解免疫抑制，同时直接影响肿瘤增殖。 |
| 参考文献 |
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