BRAF (mutated V600E) Antibody (Mouse mAb) [M8P1]
目录号: F2152
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: A375
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IHC |
| 反应性 |
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| Human |
| 抗体类型 |
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| Mouse Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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84 kDa
85 kDa,36 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Human melanoma; Caco-2 cells; A375 cells |
|---|---|
| 阴性对照 | HCT 116 cells; SW480 cells; Caco-2 cells; HT-29 cells |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
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| BRAF (mutated V600E) Antibody (Mouse mAb) [M8P1] 可检测 V600E 突变的内源性 BRAF 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
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| 细胞膜，细胞质，内膜系统，细胞核 |
| Uniprot ID |
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| P15056 |
| 克隆号 |
|---|
| M8P1 |
| 别名 |
|---|
| BRAF1, RAFB1, BRAF, Serine/threonine-protein kinase B-raf, Proto-oncogene B-Raf, p94, v-Raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1 |
| 背景 |
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| BRAF V600E 是 RAF 家族丝氨酸/苏氨酸激酶 BRAF 的一种致癌变体，其激酶结构域激活区第 600 位密码子上的缬氨酸被谷氨酸取代，产生一种组成型活性酶，该酶能够持续驱动 MAPK/ERK 信号通路，且不依赖于上游 RAS 信号输入。该激酶保留了 RAF 蛋白典型的调控和催化结构，包括 N 端 RAS 结合和调控区以及 C 端激酶结构域；V600E 突变模拟了激活区内的磷酸化，稳定了活性构象，使激酶活性比野生型 BRAF 提高数百倍，并促进单体信号传导，从而有效磷酸化 MEK1/2。 BRAF V600E持续激活MEK-ERK通路，改变调控细胞增殖、分化和凋亡的基因转录，并通过上调细胞周期蛋白D1、下调p27^Kip1以及调节促凋亡和抗凋亡因子，促进黑素细胞存活和细胞周期进程。同时，BRAF V600E还影响细胞衰老程序，并与其他损伤协同作用，克服黑色素瘤发生过程中癌基因诱导的生长停滞。BRAF V600E重塑染色质和基因表达模式，广泛改变与细胞黏附、侵袭、免疫逃逸和细胞因子信号传导相关的基因，表明该突变驱动细胞增殖，并通过MAPK依赖性转录程序重塑肿瘤微环境和转移行为。在黑色素瘤中，约一半的病例存在BRAF激活突变，其中超过90%的突变涉及V600E，这定义了一个具有特征性临床病理特征且高度依赖MAPK信号通路的主要分子亚型。BRAF V600E也存在于一种独特的结直肠癌亚型中，该亚型起源于锯齿状途径，在肿瘤发生早期即出现，并与高水平的微卫星不稳定性、CpG岛甲基化表型和右侧结肠位置相关。由于MAPK通路占主导地位，这些肿瘤通常预后不良，且对标准抗EGFR疗法的获益有限。在结直肠癌中，BRAF V600E与WNT信号通路相互作用，在缺乏常见APC突变的情况下增强WNT活性，并依赖RNF43和其他改变来维持β-catenin驱动的转录，这凸显了MAPK和WNT级联在这种侵袭性亚型中的相互作用。 BRAF V600E 在 MAPK 通路激活中的核心作用使其成为一个重要的治疗靶点，而选择性抑制剂如维莫非尼和达拉非尼，通常与 MEK 抑制剂联合使用，可显著抑制 BRAF V600 突变型黑色素瘤和转移性结直肠癌的肿瘤，而获得性耐药通常涉及通过继发性 RAS/RAF 改变重新激活 MAPK 信号传导，或激活平行通路如 PI3K。 |
| 参考文献 |
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