BRCC36 Antibody [M5D3]

目录号: F5322

抗体应用：反应性：Human, Mouse, Rat, Monkey

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
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操作要点

WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。

使用信息

稀释比例
WB1:1000 IP1:100

抗体应用
WB, IP

反应性
Human, Mouse, Rat, Monkey

抗体类型
Rabbit Monoclonal Antibody

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量
33 kDa, 40 kDa

阳性对照	PC-3 cells; TK-10 cells; U031 cells; ACHN cells; HCT-15 cells; COS-7 cells; Neuro-2a cells; C6 cells; 293T cells
阴性对照

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 60 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 60 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
BRCC36 Antibody [M5D3] 可检测内源性 BRCC36 总蛋白水平。

蛋白定位
细胞质，细胞骨架，细胞核

Uniprot ID
P46736

克隆号
M5D3

别名
Lys-63-specific deubiquitinase BRCC36; BRCA1/BRCA2-containing complex subunit 36; BRISC complex subunit BRCC36; BRCC3; BRCC36; C6.1A; CXorf53

背景
BRCC36，又称BRCA1/BRCA2复合物亚基36或BRCC3，是一种JAMM/MPN+金属蛋白酶家族的去泛素化酶，特异性水解K63连接的多聚泛素链，从而调节DNA损伤修复和先天免疫中的泛素信号通路。该蛋白由约384个氨基酸组成，包含一个MPN结构域，其第33位氨基酸为催化谷氨酸，以及一个激活环，该激活环的构象受支架蛋白（如BRCA1-A复合物中的ABRAXAS或BRISC复合物中的ABRO1）的调控。BRCC36组装成异源五聚体弧形复合物，其中以非共价二聚体的形式存在，而BRE结构域则提供UEV或RWD结构域，用于连接MERIT40和RAP80，从而实现复合物的完全整合。在BRCA1-A复合物中，BRCC36通过RAP80识别泛素而被募集到DNA双链断裂位点，在那里它去除K63连接的泛素链，从而限制DNA末端切除，抑制过度的同源重组，将BRCA1隔离在断裂位点之外，并促进非同源末端连接，以确保DNA修复的保真度。在细胞质中，BRISC-BRCC36使I型干扰素受体IFNAR1去泛素化，稳定IFNAR1以增强抗病毒信号传导和炎症反应；同时，它与SHMT2结合抑制BRCC36活性，从而将代谢和免疫联系起来，尤其是在缺氧肿瘤中。BRCC36的过表达通过减少DNA双链断裂后的细胞凋亡而导致乳腺癌的放射抗性，其模块化支架结构使其能够进行特定情境下的靶向治疗。

背景

BRCC36，又称BRCA1/BRCA2复合物亚基36或BRCC3，是一种JAMM/MPN+金属蛋白酶家族的去泛素化酶，特异性水解K63连接的多聚泛素链，从而调节DNA损伤修复和先天免疫中的泛素信号通路。该蛋白由约384个氨基酸组成，包含一个MPN结构域，其第33位氨基酸为催化谷氨酸，以及一个激活环，该激活环的构象受支架蛋白（如BRCA1-A复合物中的ABRAXAS或BRISC复合物中的ABRO1）的调控。BRCC36组装成异源五聚体弧形复合物，其中以非共价二聚体的形式存在，而BRE结构域则提供UEV或RWD结构域，用于连接MERIT40和RAP80，从而实现复合物的完全整合。在BRCA1-A复合物中，BRCC36通过RAP80识别泛素而被募集到DNA双链断裂位点，在那里它去除K63连接的泛素链，从而限制DNA末端切除，抑制过度的同源重组，将BRCA1隔离在断裂位点之外，并促进非同源末端连接，以确保DNA修复的保真度。在细胞质中，BRISC-BRCC36使I型干扰素受体IFNAR1去泛素化，稳定IFNAR1以增强抗病毒信号传导和炎症反应；同时，它与SHMT2结合抑制BRCC36活性，从而将代谢和免疫联系起来，尤其是在缺氧肿瘤中。BRCC36的过表达通过减少DNA双链断裂后的细胞凋亡而导致乳腺癌的放射抗性，其模块化支架结构使其能够进行特定情境下的靶向治疗。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31253574/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33142801/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%