CAB39/MO25 Antibody (Rabbit mAb) [H1E9]
目录号: F4709
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: MCF-7, Lane 2: HepG2, Lane 3: C6, Lane 4: COS-7
操作要点
WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP |
| 反应性 |
|---|
| Human, Mouse, Rat, Monkey |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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39 kDa
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| 阳性对照 | MCF-7 cells; HepG2 cells; HeLa cells; A204 cells; C6 cells; COS7 cells; L929 cells; C2C12 cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Tris-HCL Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Tris-HCL Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Tris-HCL Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| CAB39/MO25 Antibody (Rabbit mAb) [H1E9] 可检测内源性 CAB39/MO25 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
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| 细胞质 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q9Y376 |
| 克隆号 |
|---|
| H1E9 |
| 别名 |
|---|
| Calcium-binding protein 39, MO25alpha, Protein Mo25, CAB39, MO25 |
| 背景 |
|---|
| CAB39，又名MO25，是一种含有armadillo重复序列的支架蛋白，是LKB1-STRAD-MO25复合物的核心组成部分。该复合物作为AMPK及其相关激酶家族的主要上游激酶模块，调控细胞能量感知、极性和应激反应。CAB39由串联的armadillo重复序列构成，形成一个曲面，可与假激酶STRADα的C端Trp-Glu-Phe基序进行高亲和力相互作用。这种结合显著增强了STRADα与肿瘤抑制激酶LKB1的结合，并稳定了异源三聚体复合物。 MO25 的结合促进 STRAD-LKB1 复合物的正确折叠和胞质定位，并增强 LKB1 对下游底物的催化活性，进而导致 AMPK 以及至少十几种其他 AMPK 相关激酶的磷酸化和激活。这些激酶共同调控能量稳态、细胞极性和应激条件下的代谢适应。LKB1-STRAD-MO25 是骨骼肌等组织中主要的 AMPK 激酶复合物，MO25 作为一种重要的辅助因子，调节该复合物的稳定性和信号传导能力，而非自身提供催化活性。CAB39/MO25 也是调控 LKB1-AMPK 轴的 microRNA 的重要靶点：miR-451 直接结合 CAB39 3′UTR 中的一个保守位点，降低 CAB39 蛋白水平，从而减弱 LKB1 依赖的 AMPK 激活，使细胞转向 mTOR 信号通路，并在应激条件下增强增殖和存活。在心脏和肥厚疾病模型中，相关微RNA如miR-195和miR-451靶向CAB39转录本，并与MO25表达降低、AMPK磷酸化降低和乙酰辅酶A羧化酶磷酸化改变相关，将CAB39丰度与心肌代谢重塑联系起来。 |
| 参考文献 |
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