CAND1 Antibody (Rabbit mAb) [B17D18]
目录号: F9659
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: 293T, Lane 2: Hela, Lane 3: Jurkat, Lane 4: Saos-2
操作要点
WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
建议一抗稀释比: 1:10000
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
建议一抗稀释比: 1:10000
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
|---|
| WB, IP, IHC, IF, FCM |
| 反应性 |
|---|
| Human |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
|---|
| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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136 kDa
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| 阳性对照 | Human prostatic hyperplasia tissue; 293T cells; HeLa cells; Jurkat cells; Saos-2 cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:10000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
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实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| CAND1 Antibody (Rabbit mAb) [B17D18] 可检测内源性 CAND1 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞质，细胞核 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q86VP6 |
| 克隆号 |
|---|
| B17D18 |
| 别名 |
|---|
| KIAA0829 | TIP120 | TIP120A | CAND1 | Cullin-associated NEDD8-dissociated protein 1 | Cullin-associated and neddylation-dissociated protein 1 | TBP-interacting protein of 120 kDa A | p120 CAND1 | TBP-interacting protein 120A |
| 背景 |
|---|
| CAND1（cullin相关和NEDDylation解离蛋白1）是一个大型HEAT重复序列支架蛋白，它能结合未NEDDylation修饰的cullin-RING核心结构，并动态调控cullin-RING泛素连接酶（CRL）的组装和活性。CAND1并非作为静态抑制剂发挥作用，而是作为一种催化交换因子，重塑可用于蛋白质泛素化的底物受体模块的种类。该蛋白以马蹄形构象包裹在cullin支架蛋白（如CUL1和CUL2）周围，其N端区域阻断cullin的NEDDylation修饰位点，而C端区域占据衔接蛋白结合界面，从而阻止SKP1-F-box或其他底物受体复合物的同时结合，并稳定连接酶的“仅核心”状态。 CAND1优先结合未去NEDDylation修饰的CUL1-Rbx1，并阻断SCF（SKP1-CUL1-F-box）的组装和活性。但实时动力学和定量蛋白质组学研究表明，一旦CSN介导的去NEDDylation发生，CAND1即可催化加速F-box模块的解离和交换，速度提高几个数量级，从而驱动CUL1-Rbx1核心与不同的SKP1-F-box对快速达到平衡，并确保对可用的底物受体进行全面采样。在这个适应性循环中，底物结合促进Nedd8与CUL1的结合，从而取代CAND1并稳定活性SCF复合物，直到底物被泛素化和降解。后续的CSN去NEDDylation修饰使cullin重新开放，从而允许CAND1结合。CAND1随后解离现有的衔接蛋白复合物，并促进其他F-box模块的募集，将NEDDylation修饰状态与底物-受体周转联系起来，维持CRL1信号通路的可塑性。对于参与PROTAC靶标降解的基于CUL2的CRL2^VHL连接酶，CAND1显著促进CRL2复合物的解离，但仅微弱地促进其重组，从而抑制CRL2介导的蛋白质降解，并凸显了CAND1对不同CRL家族和特定环境的影响。在体内，CAND1作为cullin蛋白E3泛素连接酶的正调控因子，支持赤霉素信号通路中SCF^SLY1^的最佳活性，并与COP1/COP10和CUL4复合物协同作用，促进HY5降解并抑制光形态建成，从而调节多个cullin平台，而非仅仅作为一个简单的关闭开关。 CAND1通过调控CRL1的组成，影响细胞周期进程、激素和生长因子通路以及应激反应中关键调控因子的降解，其失调会扰乱正常的蛋白水解途径，进而影响代谢和再生表型。在非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）中，肝脂肪变性期间CAND1表达下调，增强CUL1-FBXO42-ACAA2复合物的组装，加速线粒体β-氧化酶ACAA2的泛素化和降解，从而降低脂肪酸分解代谢并促进脂质积累；而恢复CAND1功能则可阻断该复合物的组装，从而缓解NAFLD。在成年心脏再生过程中，CAND1表达升高促进CUL1–FBXW11–Mob1b复合物的组装以及Mob1b的K48连接泛素化，从而抑制Hippo信号通路，促进心肌梗死后心肌细胞的增殖和修复。这表明，CAND1介导的CRL1重塑可用于调控主要的生长控制通路。CAND1的HEAT重复序列支架结构、cullin neddylation和衔接蛋白界面的双重参与、催化交换因子机制，以及其在维持动态CRL库、调节激素和光信号、调控Hippo和代谢通路等方面的重要作用，使其成为泛素-蛋白酶体介导的信号通路、代谢和再生病理以及CRL靶向干预的关键调控因子。 |
| 参考文献 |
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