Caspase-7 Antibody [H18L1]

目录号: F0473

抗体应用：反应性：Human, Mouse, Rat

Lane 1: A20, Lane 2: A20 (Etoposide, 25 μM, overnight)

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
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操作要点

WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。

使用信息

稀释比例
WB1:1000

抗体应用
WB

反应性
Human, Mouse, Rat

抗体类型
Rabbit Monoclonal Antibody

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量
20 kDa, 35 kDa

阳性对照	Jurkat cell; A20 cell
阴性对照	Jurkat cell (Etoposide, 25 μM, overnight); A20 cell (Etoposide, 25 μM, overnight)

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 60 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 60 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
Caspase-7 Antibody [H18L1] 可检测内源性 Caspase-7 总蛋白水平。

蛋白定位
细胞质，细胞核，细胞外环境

Uniprot ID
P55210

克隆号
H18L1

别名
Caspase-7; CASP-7; Apoptotic protease Mch-3; CMH-1; ICE-like apoptotic protease 3; ICE-LAP3; CASP7; MCH3

背景
Caspase-7 是一种效应 caspase，属于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族，与 caspase-3 一起被认为是细胞凋亡级联反应中的关键执行者。它以无活性的前体酶形式存在，在上游起始 caspase（如 caspase-8 或 -9）的作用下，于保守的天冬氨酸残基（Asp23、Asp198、Asp206）处进行蛋白水解加工，产生一个大的 p20 亚基和一个小的 p11 亚基，它们异二聚化形成一个具有预先形成的底物结合口袋的活性异四聚体，该口袋优先结合 DEVD 基序。然而，其 apo 形式显示出柔性环，这些环在配体结合后会发生构象变化。 Caspase-7 通过切割 PARP-1 和 p23 等关键底物，在细胞凋亡过程中破坏细胞结构，这一过程既包括外源性（死亡受体触发）途径，也包括内源性（线粒体）途径。此外，Caspase-7 还通过细胞因子加工参与炎症反应，并发挥非凋亡作用，例如通过激活酸性鞘磷脂酶来调控细胞周期和修复膜孔。Caspase-7 活性失调可通过调节细胞凋亡抵抗影响癌症进展，并促进炎症性疾病的发生。

背景

Caspase-7 是一种效应 caspase，属于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族，与 caspase-3 一起被认为是细胞凋亡级联反应中的关键执行者。它以无活性的前体酶形式存在，在上游起始 caspase（如 caspase-8 或 -9）的作用下，于保守的天冬氨酸残基（Asp23、Asp198、Asp206）处进行蛋白水解加工，产生一个大的 p20 亚基和一个小的 p11 亚基，它们异二聚化形成一个具有预先形成的底物结合口袋的活性异四聚体，该口袋优先结合 DEVD 基序。然而，其 apo 形式显示出柔性环，这些环在配体结合后会发生构象变化。 Caspase-7 通过切割 PARP-1 和 p23 等关键底物，在细胞凋亡过程中破坏细胞结构，这一过程既包括外源性（死亡受体触发）途径，也包括内源性（线粒体）途径。此外，Caspase-7 还通过细胞因子加工参与炎症反应，并发挥非凋亡作用，例如通过激活酸性鞘磷脂酶来调控细胞周期和修复膜孔。Caspase-7 活性失调可通过调节细胞凋亡抵抗影响癌症进展，并促进炎症性疾病的发生。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/20942802/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/11752425/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%