CBX4 Antibody (Rabbit mAb) [P20K12]
目录号: F7579
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: HDLM-2, Lane 2: NCCIT, Lane 3: 293T, Lane 4: RAW 264.7
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP, IHC, FCM, ChIP |
| 反应性 |
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| Mouse, Rat, Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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61 kDa
74 kDa, 75 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Mouse thymus tissue; Rat thymus tissue; Mouse hippocampus tissue; Rat hippocampus tissue; Mouse cerebrum tissue; HDLM-2 cells; NCCIT cells; HCT 116 cells; HEK-293 cells; RAW 264.7 cells; C6 cells |
|---|---|
| 阴性对照 | RAW 264.7 cells; HUVEC cells |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
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| CBX4 Antibody (Rabbit mAb) [P20K12] 可检测内源性 CBX4 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
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| 细胞核 |
| Uniprot ID |
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| O00257 |
| 克隆号 |
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| P20K12 |
| 别名 |
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| E3 SUMO-protein ligase CBX4, Chromobox protein homolog 4, Polycomb 2 homolog, Pc2, hPc2, CBX4 |
| 背景 |
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| CBX4，又称染色质盒蛋白同源物4或多梳蛋白2，是一种多梳蛋白家族成员，它结合了经典的染色质读取功能和SUMO E3连接酶活性，将表观遗传抑制与翻译后修饰相结合，从而调控与发育、衰老和癌症进展相关的基因表达程序。CBX4是一种核蛋白，其N端包含一个染色质结构域，该结构域可识别赖氨酸27三甲基化的组蛋白H3；其C端区域含有SUMO相互作用基序和RING样结构域，赋予其SUMO E3连接酶活性。CBX4通过其染色质结构域结合H3K27me3标记的位点，并募集多梳抑制复合物1 (PRC1) 的组分，包括BMI1和RING1，从而促进H2AK119单泛素化，并稳定抑制发育和细胞周期调控因子的转录。除了作为PRC1的读取蛋白和募集蛋白外，CBX4还作为一种SUMO E3连接酶，修饰包括缺氧诱导因子1α (HIF-1α)在内的多种底物，从而影响它们的稳定性和活性。在肝细胞癌中，CBX4的表达与组织学分级、TNM分期、微血管密度和转移密切相关。CBX4通过SUMO化HIF-1α增强其对促血管生成基因的转录活性，从而促进血管生成和转移潜能。高水平的CBX4既是一个独立的预后不良因素，也是一个指导经动脉化疗栓塞术疗效的生物标志物。在肺腺癌中，CBX4 表现出双向转录效应：它形成 CBX4/miR-190 调控环路，其中 CBX4 抑制 miR-190 以促进细胞增殖，而 miR-190 靶向 CBX4 以限制转移；此外，CBX4 还调节 BMI1 等基因以及控制上皮-间质转化的基因的表达，凸显了其在肿瘤生长和扩散中依赖于特定情境的作用。在胃癌中，CBX4 过表达，并通过激活 CDC20 和 β-catenin 信号通路驱动肿瘤进展和干性维持。CBX4 与调控区域结合并增强 CDC20 的转录，进而支持细胞周期进程、球体形成和肿瘤起始能力。 CBX4 敲低可降低增殖、侵袭和干性标志物，表明 CBX4 是胃肠道恶性肿瘤中 Wnt/β-catenin 和有丝分裂检查点网络的核心表观遗传调控因子。在癌症之外，CBX4 还参与衰老调控：它通过 PRC1 介导的染色质调控抑制 p16INK4A 的表达，并能对衰老通路中的因子进行 SUMO 化修饰。因此，CBX4 活性的改变可以延缓或促进衰老，并影响与年龄相关的疾病，具体取决于组织环境和上游信号。 |
| 参考文献 |
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